己糖激酶法与葡萄糖氧化酶法测定血糖的实验研究

随着经济的发展和生活方式的改变，糖尿病发病率逐年增高，其患病人群已趋流行化和年轻化。目前糖尿病诊断主要依据是临床症状和血糖水平，而血糖水平是其主要诊断依据。临床实验室普遍采用葡萄糖氧化酶(GODPAP)法，己糖激酶(HK)法。实验室医学质量要求标准ISO/15189[1]对检验结果的溯源性和可比性提出了明确要求，并指出方法学比较试验(比对试验)是实现溯源的途径之一。是临床实验室质量的保证。依据美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)和中华人民共和国卫生行业标准的有关文件对己糖激酶法(HK 法)与葡萄糖氧化酶法(GODPAP法)测定血糖的总不精密度、正确度及线性进行评价，以及对两种测定方法进行相关性比较。

1　资料与方法

1.1　仪器与试剂　Cobas8000 全自动生化分析仪;OLYMPUSAU2700全自动生化分析仪。HK 法所用试剂为Cobas8000全自动生化分析仪原装配套;GODPAP 法所用试剂由柏定生物工程有限公司生产，按说明书设置上机参数。多项校准液：校准品CFAS 批号165676 ;伯乐质控血清批号16641和16642。

1.2　临床标本　本院住院患者，空腹12～14h后，坐位采集静脉血6mL，室温静置，凝集后3500r/min ，离心半径17.5cm，离心10min，血清样品在2h内分离出血清，3h内分析完毕[2]。

1.3　评估方法

1.3.1　精密度　参考NCCLS制定的精密度和正确度性能的用户验证(EP15A2)[3]文件进行，分别用2 种方法进行，伯乐质控血清2份，1份正常，1份病理，每天进行一批实验，每个浓度重复测定3次，共测定5d。计算批内标准差及总不精密度。

1.3.2　正确度　参考美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)制定的精密度和正确度性能的用户验证(EP15A2)的文件[3]进行，选用与实验室现用批号(165676)不同的罗氏校准液CFAS(165681)，分别用2 种方法进行，每天重复测定2次，共测定5d。将2种方法的测定结果与定值比较。计算偏倚，并对2种方法的均数分别与定值进行狋检验。

1.3.3　HK 法与GODPAP法用于临床标本的相关性比较　HK 法在Cobas8000 全自动生化分析仪上测定;GODPAP 法在OLYMPUSAU2700全自动生化分析仪上测定。参考美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)制定的用患者样本进行方法学比对和偏倚评估(EP9A2)文件[4]进行。选择40 份包含高、中、低浓度的临床样本，每天取8份，分别用2 种方法按顺序1～8进行样本测定，再按相反顺序8～1重复测定，连续测定5d，共测定40 个样本，以HK 法为比较方法(Y)，GODPAP法为实验方法(x)，将两种方法的测定结果进行比较，回归与相关性分析、偏差分析及狋检验。

1.3.4　线性　参考美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)制定的定量分析方法的线性评价(EP6A)[5]和WS/T4088临床化学设备线性评价指南[6]的文件进行，对2种方法的线性范围进行评价。样本准备，收集患者血清，待测物浓度高值和低值包含仪器可能检测到的最高和最低界限，作为低浓度(L)和高浓度(H)样品;再按下列比例：3份低值+1份高值，2份低值+2份高值，1份低值+3份高值，制成5份系列线性评价血清样品。每个浓度重复测定4次。对结果作线性评价。

1.4　统计学处理　采用Microsoft Office Excel2003 和SPSS13.0统计学软件，对检测结果进行分析。总不精密度评价精密度，正确度采用单个样本狋检验评价，两种方法的比较采用回归分析、相关分析、偏差分析及配对狋检验，以犘<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1　精密度　己糖激酶与GODPAP 法总不精密度均小于3%，符合中华人民共和国卫生行业标准WS/T403[7]要求。

2.2　正确度　GODPAP法和己糖激酶法正确度偏倚程度符合要求，GODPAP法的均值与定值比较，经狋检验，t=1.551， p=0.155，己糖激酶法的均值与定值比较，经狋检验，t=1.743，p=0.115。两种方法均值与定值比较差异无统计学意义(p>0.05)。

2.3　方法学比较

2.3.1　回归分析和相关分析n=40，线性回归方程：y=0.988x+0.053，(Sy，x)=0.184。二次多项式y=0.977x1+0x2+0.100，(Sy，x)=0.186。复合函数(Sy，x)=0.194。根据回归分析的标准误(Sy，x)的大小，以最小者确定最适合其中，线性方程最优(y=0.988x+0.053)。结果见图1，相关系数为0.999，p=0.000，说明实验方法与比对方法具有显著的相关性。

2.3.2　测定结果可接受性判断　参考NCCLS标准化文件中EP15A2[3]的统计方案，对2种方法检测结果进行分析。相对偏倚(0.31%)小于中华人民共和国卫生行业标准WS/T403[7]的要求(B=2.00%)，则认为偏倚可接受;GODPAP 法与HK法检测结果可接受，见图2，x轴表示比对方法，y轴表示偏倚(实验方法比对方法)。

2.3.3　差异性分析　2种方法的均值作比较，采用配对狋检验中的差异均值进行分析[8]，t=1.754，p=0.087。因此认为总体上2种方法的结果比较，差异无统计学意义(p>0.05)，具有可比性。

2.4　线性范围结果

2.4.1　GODPAP法　线性回归方程：y=1.011x-0.066，(Sy，x)=0.337。二次多项式：y=1.055x1 -0.002x2 -0.248，(Sy，x)= 0.377。复合函数：(Sy，x)=0.625，根据回归分析的标准误(Sy，x)的大小，以最小者确定最适合方程，其中线性方程为最优，见图3，相关系数(r)=0.999，p=0.000，在0.01水平(双侧)上显著相关，说明实验值与预期值呈显著相关。

2.4.2　HK 法　线性回归方程：y=1.002x-0.007，Sy，x=0.168。二次多项式：y=1.017x1 +0x2 -0.082，Sy，x=0.183复合函数Sy，x= 0.593，根据回归分析的标准误Sy，x，以最小者确定最适合，其中线性方程为最优，见图4。相关r=1.000，p=0.000在0.01 水平(双侧)上显著相关，说明实测值与预期值呈显著相关.实验范围内两种方法线性关系良好。见表3。表3　　HK 法与GODPAP法的线性测定结果方法测定范围斜率截距相关系数犘GODPAP法1.08～28.0 1.011 -0.066 0.999 0.000HK 法1.57～38.5 1.002 -0.007 1.000 0.000图3　　GODPAP法线性回归分析图4　　HK 法线性回归分析

3　讨　　论

葡萄糖是人体内新陈代谢的重要物质，是人体能量的主要来源之一[9]。血糖测定的常规方法包括GODPAP 法和HK法(其中参考方法为HK 法)[10]。参考美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)标准化文件中的EP15A2 对HK 法与GODPAP 法的精密度进行评价，总不精密度较小，均小于2.5%，符合中华人民共和国卫生行业标准WS/T403[7]的要求。表明2种方法的变异较小，稳定性较好。参考NCCLS标准化文件中EP15A2 对HK 法与GODPAP法的正确度进行评价，GODPAP法与HK 法正确度偏倚符合要求，GODPAP 法的均值与定值比较，经狋检验，r=1.551，p=0.155;HK 法的均值与定值比较，经狋检验，r=1.743，p=0.115，2种方法的均值与定值比较，差异无统计学意义(p>0.05)，表明2种方法的准确性较好。参考NCCLS 标准化文件中EP9A2，对HK 法与GODPAP法的进行比较，相关系数(r)=0.999，表明结果之间有较高的相关性，同时用配对狋检验(犘=0.87)又表明两者方法具有良好的一致性。均能准确地反映血液中葡萄糖的浓度值。参考中华人民共和国卫生行业标准WS/T403[7]的偏倚为判断标准，相对偏倚(0.31%)小于或等于实验室允许偏倚2.00%，则认为偏倚可接受;表明两种方法有很好的可比性。参考NCCLS标准化文件的“定量分析方法的线性评价(EP6A)[3]”和WS/T408“临床化学设备线性评价指南”[6]的文件，对HK 法与GODPAP 法的线性范围进行评价，HK 法相关系数r=1.000，GODPAP 法相关系数r=0.999，实测值与理论值线性关系良好，表明两者在临床范围均具有较好的准确度。依据以上实验数据，GODPAP 法与HK 法的稳定性，正确度，线性均较好且两者具有很好的相关性。比较而言，HK法为参考方法，价格昂贵，反应速度快，线性范围较宽，而GODPAP法的特点是只要样品的某个反应完成，就能看到该项目的结果，经济实用，所以更适合于急诊检验，现在很多大医院拥有不止一台的生化仪，而试剂也有多个厂家，方法也有多种，这就有必要对不同仪器方法做出评估。实验表明，葡萄糖的两种方法均能满足临床要求，适用于葡萄糖的常规和自动化分析。

参考文献

[1] 魏昊，丛玉隆.医学实验室质量管理与认可指南[M].北京：中国计量出版社，2004 ：7275 .

[2] NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards.Proceduresforthehandlingandprocessingofbloodspecimens[S].Wayne，PA，USA：NCCLS，1990.

[3] NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards.UserVerificationof Performancefor Precision and Trueness：ApprovedGuidelineSecondedition[S].EP15A2，2004.

[4] NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards.MethodofComparisonandBiasEstimationUsingPatientSamples：ApprovedGuidelineSecondedition[S].EP9A2，2002.

[5] NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards.EvaluationoftheLinearityofQuantitative MeasurementProceduresA StatisticalApproach：Approved GuidelineSecondedition[S].EP6A2，2003.

[6] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.WS/T4082012：临床化学设备线性评价指南[M].北京：中国标准出版社，2012.

[7] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员.WS/T4032012：临床生物化学检验常规项目分析质量指标[M].北京：中国标准出版社，2012.

[8] 冯仁丰.临床检验质量管理技术基础[M].上海：上海科学技术文献出版社，2007：188190.

[9] 贾珂珂，陈文祥，张捷，等.血清葡萄糖参考方法的复现及与临床常用检测方法的比对研究[J].中华检验医学杂志，2009，32(3)：347.

[10]陈文祥，申子瑜，郭健，等.临床检验量值溯源中的重要术语与概念及有关问题[J].中华检验医学杂志，2005，28(2)：142146.

(收稿日期：20131208)