辛伐他汀对人慢性粒细胞白血病细胞K562基因表达的影响

　　作者：黄文芳,杨永长,传良敏,刘华　　作者单位：1. 四川省医学科学院四川省人民医院检验科，四川成都 610072;2. 重庆医科大学医学检验系，重庆 400016

　　【摘要】目的 应用基因芯片技术研究辛伐他汀对K562细胞基因表达的影响，初步探讨其作用机理。方法 辛伐他汀作用K562细胞48h后，提取细胞总RNA。纯化mRNA后再逆转录为cDNA，将cDNA在体外转录合成cRNA，用随机引物反转录为cDNA，用Klenow酶标记Cy3、Cy5，与定制的包含人全基因组的基因芯片杂交，扫描芯片荧光信号，用GenePix Pro 4.0图像分析软件对芯片图像进行分析。定量RTPCR验证芯片结果中两个差异表达基因。结果 基因芯片检测发现共有176条基因表达发生明显改变，包括16条未知基因表达改变。其中151条基因表达上调，25条基因表达下调。根据基因功能的不同，我们初步将其分为凋亡相关、信号转导相关、细胞周期相关等几大类。定量RTPCR验证的基因表达变化趋势与表达谱芯片的结果相吻合。结论 辛伐他汀作用K562细胞后能引起多种基因表达改变，这为探讨其作用机制提供了新的依据。

　　【关键词】 K562细胞,辛伐他汀,基因芯片;慢性粒细胞性白血病

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effect of simvastatin on gene expression profiles of K562 cells and to elucidate its mechanism. Methods The total RNA of K562 cells treated with or without simvastatin for 48h was extracted and purified, followed by cDNA synthesis, then in vitro transcription reaction was subjected to synthesizing cRNA, which was transcripted into cDNA using random primers. cDNA labelled Cy3 and Cy5 by Klenow enzyme was hybridized with genechip, then the chip was scanned with ScanArray Express Scanner, and obtained images were analyzed with GenePix Pro4.0. Finally, two differentially regulated genes were validated by real time RTPCR. Results There were 176 differential expression genes between simvastatintreated group and untreated group, including 16 unidentified genes. Expression of 25 genes was downregulated and that of 151 genes was upregulated in the treatment group compared to the untreated group. According to the functions of these genes, they were classified into apoptosisrelated, signal transduction and cell cycle related genes. Two differential expression genes in genechip were conformed by real time RTPCR. Conclusion Simvastatin can regulate expression of many genes in K562 cells, which might provide novel foundation for its anticancer mechanism.

　　KEY WORDS: K562 cell; simvastatin; genechip; chronic myelocytic leukemia

　　K562细胞是Lazzio等人在1957年建立的人慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia, CML)细胞系。CML是一种与染色体异常有关的癌症，占整个白血病发病率的20%。CML细胞中，BCRABL持续激活Ras信号途径，细胞无限增殖且凋亡受阻，阻断Ras信号转导是目前CML治疗的主要策略。他汀类药物是80年代后期开发的一类羟甲基戊二酸单酰辅酶A(3hydroxy3methylglutaryl CoA, HMGCoA)还原酶抑制剂，能抑制胆固醇合成，目前已广泛用于临床治疗高胆固醇血症。研究发现他汀类药物能阻止肿瘤细胞Ras分子活化，协同抗肿瘤药物诱导细胞死亡[1]，提示他汀类药物可用于治疗CML。辛伐他汀是他汀类药物的一种已有研究表明辛伐他汀能抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡[2]，但其具体机制目前尚不完全清楚。本实验采用基因芯片技术分析了辛伐他汀处理K562细胞后基因表达的变化，为探讨其作用机制提供了重要线索。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　辛伐他汀购自中国药品生物制品检定所，人慢性粒细胞白血病K562细胞系购自四川大学华西免疫室，MMLV逆转录酶，TRI Reagent购自美国Invitrogen，Rnasin、Klenow酶购自日本TaKaRa，T7oligo(dT)15、9 mer Random Primer购自上海博亚生物技术有限公司。cDNA Synthesis Kit、T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System购自美国Promega。PCR NucleoSpin Extract II Kit，RNA Cleanup Kit购自德国MACHEREYNAGEL。人类全基因组表达芯片，LuxScan 10KA双通道激光扫描仪由CapitalBio公司提供。

　　1.2 细胞培养与药物处理

　　收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为1.0×105个/mL，实验组加入辛伐他汀，其终浓度为20μmol/L，对照组加入等量与实验组乙醇浓度相同的RPMI 1640培养液，37℃、饱和湿度、50mL/L CO2条件下培养48h后收集细胞。

　　1.3 RNA抽提与纯化

　　TRI Reagent提取细胞总RNA(操作按Invitrogen公司RNA提取试剂盒说明书)，采用德国MACHEREYNAGEL的RNA Cleanup Kit(参照RNA Cleanup Kit纯化说明书)纯化RNA。 纯化后的总RNA用12g/L甲醛变性凝胶电泳检测RNA的质量。

　　1.4 荧光探针的制备

　　取5μg total RNA，以T7Oligo(dT)15为引物，用cDNA Synthesis Kit合成双链cDNA;双链合成后用PCR NucleoSpin Extract Ⅱ Kit纯化。用T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System将双链cDNA进行体外转录合成cRNA;然后用RNA Cleanup Kit纯化。取2μg cRNA，用MMLV反转录酶，9 mer Random Primer进行反转录，反转录产物用PCR NucleoSpin Extract Ⅱ Kit纯化。取2μg cRNA反转录产物，以9 mer Random Primer为引物进行Klenow酶标记，标记产物用PCR NucleoSpin Extract Ⅱ Kit纯化，抽干。

　　1.5 杂交与清洗

　　标记的DNA溶于30μL杂交液中(3×SSC，2g/L SDS，5×Denharts，25g/L甲酰胺)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含2g/L SDS，2×SSC的液体中洗5min，而后在0.2×SSC中室温洗5min。芯片甩干后即可用于扫描。

　　1.6 芯片扫描与杂交图像分析

　　用ScanArray 3000激光共聚焦扫描仪对芯片进行扫描。采用GenePix Pro 4.0图像分析两种荧光Cy3与Cy5的强度和比值。为排除假阳性结果，取四张芯片共同的差异表达基因作为本次实验的结果。

　　1.7 定量RTPCR验证差异表达基因

　　随机选取芯片结果中有差异表达的基因AXUD1、TNFRSF9，以actin为内对照(引物见表1)，分别用对照组和20μmol/L辛伐他汀组的逆转录产物cDNA为模板，SYBR Green Ⅰ染料法定量RTPCR检测基因表达，采用分析软件获得循环阈值(threshold cycle, Ct)和扩增效率E，利用公式R=(1+Etarget)△Ct target(controltest)/(1+Eref)△Ct ref(controltest)计算基因相对表达量。表1 Real time定量RTPCR引物序列(略)

　　2 结 果

　　2.1 甲醛变性凝胶电泳检测RNA质量

　　RNA样品电泳条带清晰，28S比18S RNA条带亮度接近2∶1，RNA完好无降解，质量符合实验要求(图1)。

　　2.2 基因芯片杂交后荧光信号的扫描

　　利用ScanArray 3000激光共聚焦扫描仪进行荧光信号的扫描，通过两个Channel分别对Cy3和Cy5荧光素进行整张芯片的扫描。对某一点Cy3与Cy5的叠加荧光信号，如果Cy3信号较强，该点显绿色(下调趋势)，如果Cy5信号较强，该点显红色(上调趋势)，如果强度相似，即显黄色(图2-图4)。GenePix Pro4.0图像分析两种荧光Cy3与Cy5的强度和比值(Ratio)可判断差异表达基因。

　　2.3 差异表达基因的筛选

　　一般认为比值在0.5-2.0的基因不存在显著的表达差异，而在该范围之外的基因则被认为表达出现显著改变。本实验以Ratio>2.0为基因表达上调，Ratio<0.5为基因表达下调。辛伐他汀作用K562细胞后，基因芯片检测发现共有176条基因表达发生明显改变，包括16条未知基因表达改变。其中151条基因表达上调，25条基因表达下调。根据基因功能的不同，我们初步将其分为凋亡相关、信号转导相关、细胞周期相关等几大类(表2)。表2 辛伐他汀作用K562细胞48h后部分差异表达基因(略)

　　2.4 定量RTPCR检测结果

　　定量RTPCR结果表明辛伐他汀处理组K562细胞中AXUD1、TNFRSF9基因的相对含量较对照组显著增加，处理组与对照组的Ratio值分别为5.03和20.41，提示定量RTPCR验证的基因表达变化趋势与表达谱芯片的结果相吻合(表3)。表3 差异表达基因定量RTPCR检测结果(略)

　　3 讨论

　　基因芯片结果显示约0.8%的基因具有2倍表达水平的差异，芯片中共有表达差异的基因176条，包括16条未知基因表达改变。其中151条基因表达上调，25条基因表达下调。同时定量PCR验证的AXUD1、TNFRSF9基因表达变化趋势与表达谱芯片的结果相吻合，证明基因芯片的可靠性和在研究基因功能及其机制中应用的可行性。表2中列出的部分表达变化显著的基因包括凋亡相关、信号转导相关和细胞周期相关等几大类，这其中MIPEP、SKP2等基因表达下调，而OPTN、BNIP3L、CDKN1A等基因表达上调。我们初步认为这些差异表达基因与辛伐他汀抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡的分子机制可能存在较大的关系。

　　BNIP3L是从人胎肝cDNA文库中克隆得到的具有抑瘤活性的基因，定位于8p21。2004年宾夕法尼亚州大学Abramson癌症中心Wafik ElDeiry研究组发现，P53和缺氧诱生因子(HIF)能开启BNIP3L导致细胞死亡[3]，说明上调或开启BNIP3L可治疗肿瘤。辛伐他汀作用K562细胞后，BNIP3L基因表达上调，提示BNIP3L可作为慢性粒细胞白血病治疗的靶点。PPP1R15A是GADD家族中的一员，编码DNA损伤和生长停止诱导因子GADD34，可通过P53磷酸化和诱导P21表达诱导细胞凋亡[4]。CDKN1A编码细胞周期抑制蛋白P21，可结合cyclinCDK并抑制其活性，受P53蛋白的调控。研究发现P21可以与PCNA相互作用，在S期DNA复制和DNA修复中起重要作用，并与细胞凋亡有关，可能在caspase活化后执行细胞凋亡。

　　TNFRSF10B、TNFRSF9含有死亡受体域，可通过形成TNFaTNFRTRADDFADD复合物激活下游的caspase3或caspase7，导致细胞凋亡。OPTN基因编码的蛋白与腺病毒E314 蛋白相互作用，通过TNFα或 FasL途径介导细胞凋亡。TNF和TNFR结合后可激活两条信号通路：一条是FADD(FASassociated death domain)介导的凋亡通路;一条是TRAF2NFκB介导的抗凋亡通路。肿瘤细胞中后一条通路的活性明显要比前一条大得多，提示肿瘤细胞中抗凋亡机制明显占优势。研究中发现辛伐他汀作用K562细胞后含死亡受体域的TNFR家族基因表达明显升高，抵抗其抗凋亡的作用。同时OPTN基因表达明显升高，参与Fas或TNFα诱导的凋亡。提示辛伐他汀诱导K562细胞凋亡可能通过死亡受体途径，但其具体机理还需要进一步研究。

　　DDIT3(GADD153)广泛表达于哺乳动物细胞，其编码的蛋白属于CCAAT增强子相连蛋白的转录因子C/EBP家族。DDIT3过表达能抑制细胞周期进程并诱导细胞凋亡[56]。Niknejad等[7]发现GADD153-/-小鼠胚胎成纤维细胞能抵抗洛伐他汀诱导的凋亡。本实验中，辛伐他汀作用K562细胞后，DDIT表达升高，同时GADD153蛋白表达水平也升高(同期实验Western blotting结果，本文未显示)，提示辛伐他汀可能通过内质网应激诱导K562细胞凋亡。

　　辛伐他汀还可调节细胞周期进程相关基因表达，这些基因的功能涉及细胞有丝分裂，DNA复制、修复和细胞周期调控等。这些表达改变的基因可能与辛伐他汀抑制K562细胞增殖有关，我们将辅以其他的方法进一步深入研究。

　　【参考文献】

　　[1]Dai Y, Khanna P, Chen S, et al. Statins synergistically potentiate 7hydroxystaurosporine (UCN01) lethality in human leukemia and myeloma cells by disrupting Ras farnesylation and activation [J]. Blood, 2007, 109(10):44154423.

　　[2]任汉云，张念先，徐红，等. 胆固醇合成抑制剂辛伐他汀对K562细胞增殖和凋亡的作用 [J]. 中华血液学杂志, 2001, 22(2):7275.

　　[3]Fei P, Wang W, Kim SH, et al. Bnip3L is induced by p53 under hypoxia, and its knockdown promotes tumor growth [J]. Cancer Cell, 2004, 6(6):597609.

　　[4]Yagi A, Hasegawa Y, Xiao H, et al. GADD34 induces p53 phosphorylation and p21/WAF1 transcription [J]. J Cell Biochem, 2003, 90(6):12421249.

　　[5]Han XJ, Chae JK, Lee MJ, et al. Involvement of GADD153 and cardiac ankyrin repeat protein in hypoxiainduced apoptosis of H9C2 cells [J]. J Biol Chem, 2005, 280(24):2312223129.

　　[6]Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress [J]. Cell Death Differ, 2004, 11(4):381389.

　　[7]Niknejad N, Morley M, Dimitroulakos J. Activation of the integrated stress response regulates lovastatin induced apoptosis [J]. J Biol Chem, 2007, 282(41):2974829756.