凝血酶与肿瘤的血管新生

　　作者：石建霞,顾健　　作者单位：扬州大学临床医学院，扬州市血液研究所，扬州 225001

　　【摘要】凝血酶是止血过程中的核心因子，近年来的研究发现凝血酶通过多种途径促进肿瘤的生长、转移及血管新生。抗凝治疗不仅缓解了肿瘤的高凝状态，而且也能抑制肿瘤的生长和转移。本文就凝血酶及其受体、凝血酶及其受体与肿瘤生长、转移及血管新生的关系、凝血酶影响肿瘤血管新生的可能机制及抗血管新生和抗凝治疗的应用前景进行了综述。

　　【关键词】 凝血酶

　　Abstract Thrombin is the most important factor in hemostasis. In recent years，it has been found that thrombin is a potent mitogen capable of inducing cellular functions. Therefore，it is proved to be of importance in promoting the growth，metastasis and angiogenesis of cancer. Anticoagulant therapy not only reduce the characteristic hypercoagulability of cancer，but also inhibits growth and metastasis of cancer，and alters the fundamental biology of cancer. In this paper thrombin and its receptor，relationship of thrombin and its receptor with cancer growth，metastasis and angiogenesis，the mechanisms of thrombin influence on cancer angiogenesis，as well as application prospects on anti-angiogenesis and anti-coagulation therapy were reviewed.

　　Key word thrombin;PAR;angiogenesis;vascular endothelial growth factor;cancer

　　早在1865年，Trousseau就观察到肿瘤与血栓存在一定的联系：发生血栓的患者通常有未检测出的肿瘤存在;同样，肿瘤患者也有高发血栓的危险。凝血酶是止血过程中的核心因子，近年来它在肿瘤生长、浸润、转移及血管新生中的作用日益受到关注，对其深入的研究将为探索肿瘤的发生发展机制、寻找新的治疗方法提供了新的思路。

　　凝血酶及其受体

　　除了激活其它凝血因子、参与止血与血栓的形成过程，凝血酶也是一种重要的有丝分裂原，能诱导许多细胞功能。它在细胞内功能的发挥主要依赖细胞表面的凝血酶受体即蛋白酶活化受体(protease-activated receptor，PAR)。PAR属于膜受体超家族，由7个结构域组成并与G蛋白偶联。在内皮细胞、血小板、单核细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞都有表达，目前发现有4种PAR受体，即PAR1、2、3、4。其中PAR1、2、4是凝血酶特异性受体，而研究最为广泛的是PAR1。凝血酶通过与PAR结合引起受体膜外N端精41-丝42肽链切开，在N端暴露一个新的肽段，这个新肽段作为"被栓"配体，从而自身激活受体，触发钙内流及一系列第二信使，活化丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，引起细胞合成与释放生长因子、黏附分子、炎症介质等参与细胞功能的调节。

　　凝血酶及其受体与肿瘤的生长、转移及血管新生

　　近年来众多的体内、体外及临床观察均证实，凝血酶及其受体具有促进肿瘤的生长和转移的作用。Hernandez-Podriguez等[1]发现，骨肉瘤患者发生肺转移后，支气管肺泡灌洗液中凝血酶含量达8×10-9mol/L，比未发生转移的高100倍，表明凝血酶的含量与骨肉瘤的肺转移成正相关性。

　　凝血酶的含量越

　　高发生转移的风险越大。Rudroff等[2]体外实验发现，凝血酶和凝血酶受体活化肽能增加胰腺癌细胞与细胞外基质和内皮细胞的黏附能力，而凝血酶受体抑制肽能抑制这种作用，表明凝血酶及其受体在肿瘤细胞生长和转移中有协同作用。Hu等[3]在小鼠模型中发现，凝血酶特异性抑制剂水蛭素能抑制经皮注射的肿瘤细胞的生长，促使肿瘤团块中心坏死，并抑制了肿瘤的血道转移。Rickles等[4]研究乳腺癌细胞株和乳腺组织发现，高水平PAR与肿瘤的侵袭潜能直接相关。正常的或良性的乳腺标本几乎检测不到PAR表达，而在浸润性导管癌PAR则高表达。用PAR的反义cDNA转染具有转移潜能的MDA-435乳腺癌细胞株，可显著降低它的侵袭潜能。

　　凝血酶影响肿瘤血管新生的可能机制

　　凝血酶通过诱导内皮细胞表达黏附分子如P-选择蛋白、CD40配体、αvβ3促进肿瘤细胞与内皮细胞、血小板及细胞外基质的黏附，有助于肿瘤的生长。凝血酶也能促进生长因子、趋化因子及细胞外蛋白的合成与释放，促进肿瘤细胞的增殖和迁移[4]。然而，凝血酶对肿瘤的生物学行为的影响作用，主要是通过促进肿瘤的血管新生而发挥的。它能通过下列两种途径促血管新生：一是凝血非依赖途径，凝血酶与PAR受体结合诱导细胞内信号通路促进血管新生;二是凝血依赖途径，它通过降解纤维蛋白原产生纤维蛋白，纤维蛋白具有促进血管新生作用

　　凝血酶和血管新生：凝血非依赖途径

　　凝血酶诱导VEGF表达 凝血酶与其受体PAR结合活化细胞内p42/p44 MAPK，在正常含氧状态下MAPK活化之后使真核转录因子Sp1苏氨酸453和苏氨酸739磷酸化，活化的Sp1与活化蛋白-2(activated protein，AP-2)形成转录因子复合体，结合于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)启动子(-88/-66)GC富含区，促进VEGF的转录。在低氧状态下MAP活化后可直接使低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)磷酸化，从而增加了HIF-1依赖的VEGF的转录活性[5，6]。Huang等[7]发现，用0.5 U/ml凝血酶与人原代成纤维母细胞 FS4 、前列腺癌细胞株DU145和巨核细胞株CHRF 共培养，在2-4小时后VEGF mRNA增高2-4倍。进一步研究发现，在该体系中凝血酶与其受体PAR结合激活了PI3激酶和丝氨酸-苏氨酸激酶，增加了转录的VEGF mRNA的稳定性，从而减少了VEGF mRNA的降解，间接增加了VEGF的合成与释放。

　　凝血酶诱导VEGFR表达 Tsopanoglou等[8]发现，人脐静脉内皮细胞经凝血酶处理后能增加它对VEGF的敏感性。RT-PCR分析表明凝血酶呈时间、剂量依赖的方式上调VEGF受体(KDR和flt-1)的mRNA表达。1.5 U/ml凝血酶作用8-12小时能最大化诱导VEGF受体mRNA表达。各种信号通路的激动剂和阻滞剂研究表明，凝血酶通过活化蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和MAP激酶，增加VEGF受体mRNA的转录效率来上调该受体的表达。

　　凝血酶上调αvβ3整合蛋白表达 Tsopanoglou等[9]报道，凝血酶能显著增加人内皮细胞αvβ3的mRNA和蛋白水平。αvβ3与固定化的凝血酶结合能促进内皮细胞的黏附、迁移与存活。体外研究表明，αvβ3的拮抗剂能抑制凝血酶诱导的鸡绒毛膜尿囊系统的血管新生。

　　凝血酶增加毛细血管的通透性使血浆外渗，为新生血管提供营养与必要的基质。凝血酶增加毛细血管的通透性的可能机制为： ①凝血酶与其受体结合活化了偶联的G蛋白，导致细胞内cAMP浓度降低、钙离子和甘油二脂浓度增加。cAMP和钙离子都有调节内皮细胞的屏障功能，钙离子有促进内皮细胞通透性增加，而cAMP能抑制这种作用;②凝血酶与其受体结合使肌球磷酸化导致收缩纤维形成，促发肌动球蛋白收缩;③凝血酶通过钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶、蛋白激酶C和酪氨酸蛋白激酶促进内皮细胞骨架重组，从而改变了血管的通透性[10]。

　　此外，凝血酶能增加基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9的表达，促进细胞外基质的降解，有利于肿瘤细胞及内皮细胞的迁移[11]。凝血酶可通过激活丝氨酸-苏氨酸激酶促进血管生成素-2表达，血管生成素-2具有促血管新生作用[12]。凝血酶与血小板表面受体结合能活化血小板可使其释放各种促进血管新生的生长因子[4]。凝血酶与单核细胞表面PAR受体结合促使它合成与释放IL-1、IL-6，这些炎症因子也参与组织损伤和肿瘤的血管新生过程[13]。

　　纤维蛋白和血管新生：凝血依赖途径

　　凝血酶和VEGF能增加毛细血管的通透性，血浆纤维蛋白原渗透到血管外组织并结合于特定的肿瘤细胞或炎性细胞的表面受体，并由局部生成的凝血酶裂解形成纤维蛋白，沉积在肿瘤组织周围起支架作用促进肿瘤的生长和转移。

　　研究发现，血浆水平的纤维蛋白肽A与纤维蛋白的生成、肿瘤的生长及恢复存在相关性。许多肿瘤组织有交叉连接的纤维蛋白的沉积如乳腺癌、前列腺癌、肺肿瘤及脑肿瘤。并且良、恶性肿瘤组织中交叉连接的纤维蛋白的含量也不同。如从乳腺癌和良性乳腺肿瘤的标本中可以发现，浸润癌新生血管内皮细胞上有交叉连接的纤维蛋白的沉积，而良性的肿瘤则没有纤维蛋白的沉积[4]。

　　裂解或降解的纤维蛋白原暴露分子中的结构位点，促进了细胞与基质黏附，这种作用在肿瘤的血管新生中有重要的作用。纤维蛋白β链的15-42氨基酸残基与内皮细胞血管内皮钙调蛋白结合，激活细胞内信号通路，促进血管新生。纤维蛋白能上调αvβ3表达，αvβ3与纤维蛋白α链252-254、572-574氨基酸的RGD(精-甘-天冬)序列结合，促进内皮细胞迁移到纤维蛋白血凝块的内部增殖、分化[14]。体外研究表明，在纤维蛋白琼脂的培养基的人上皮细胞表达的αvβ3 mRNA比在胶原琼脂培养基上表达的明显增多，并且发现用富含胶原的组织代替成熟的肉芽组织中的纤维蛋白组织时，内皮细胞的αvβ3整合蛋白的表达减少，从而抑制了肉芽组织中毛细血管的新生过程[15]。肿瘤组织可通过多种途径分泌VEGF，VEGF能增加毛细血管的通透性，使血浆纤维蛋白不断外渗，从而提供了一个持续的促血管新生的微环境。

　　纤维蛋白除了促进细胞与基质的接触，同时它也是各种生长因子如bFGF、VEGF、胰岛素样生长因子-1等的储存池，同时保护这些因子不受酶的降解。纤维蛋白基质被降解后，它能释放这些生长因子，促进内皮细胞、肿瘤的生长、分化、增殖及迁移[4]。另外，纤维蛋白也能诱导内皮细胞合成和释放IL-8，通过自分泌或旁分泌途径促使内皮细胞表达组织因子(tissue factor，TF)、VEGF，因而形成一个促血管新生的恶性循环[16]。

　　纤维蛋白在肿瘤的生长和转移中起重要作用，但纤维蛋白缺失的小鼠研究表明，该作用不是必需的。Palumbo等[17]发现，缺失纤维蛋白的肿瘤的生长情况与对照组无差别。尽管缺少纤维蛋白不影响原发肿瘤的生长，但能显著减少肿瘤的转移，这可能是降低了转移细胞的黏附能力与稳定性所致。凝血酶的抑制剂水蛭素能进一步降低纤维蛋白缺失小鼠的转移潜能，表明凝血酶的凝血途径和凝血非依赖途径对肿瘤的转移中有协同作用[18]。

　　抗血管新生和抗凝治疗的应用前景

　　由于肿瘤的生长和转移需要新生血管，所以针对肿瘤血管的抗血管新生成为一种治疗肿瘤的新策略。与传统化疗相比，它的毒副作用低，病人易于耐受。但近来许多临床试验表明，抗血管新生药物能显著增加动静脉血栓的发生率，如VEGFR-2拮抗剂SU5416、 反应停等。这种治疗引起深静脉血栓的病理生理原因目前还不清楚。推测，可能是由于化疗及抗血管新生药物对血管内皮细胞的协同损害所致[19]。

　　抗凝治疗应能缓解肿瘤的高凝特征及抑制肿瘤的生长和转移，然而从正在的进行大规模动物及I期临床试验研究来看，还不能提供足够的证据表明该治疗能显著提高肿瘤患者的存活率。用低分子量肝素(low-molecular-weight heparin，LMWH)预防治疗肿瘤患者，各家报道的效果不一，效果不尽如人意。近来一个前瞻性的研究以评估LMWH对伴或不伴有血栓并发症的肿瘤患者存活率的影响，结果表明，LMWH不能明显改善肿瘤患者的存活率 [20]。所以，以凝血酶为靶点的抗凝及抗血管新生治疗的临床应用有待于进一步研究。

　　近来研究表明，某些抗凝物质同时具有抑制血管新生的作用如抗凝血酶(antithrombin，AT)，它能阻止细胞从G1向S转变，抑制细胞增殖;还能抑制内皮细胞表面促血管生成的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(proangiogenic heparan sulfate proteoglycan，HSPG)和基底膜蛋白多糖的表达。碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和基底膜蛋白多糖能刺激内皮细胞的增殖和血管新生，AT能阻断上述途径抑制血管新生[21]。如果在动物或临床前试验能证明，AT在体内有抗血管新生作用，那么联合应用标准化疗及这种抗凝药应能更好地抑制肿瘤的生长和转移，并能减少肿瘤患者的血栓并发症，我们将拭目以待这个新的治疗方法。

　　【参考文献】

　　1Hernandez-Rodriguez NA，Correa E，Sotelo R，et al. Thrombin is present in the lungs of patients with primary extremity osteosarcoma and pulmonary metastases. Int J Biol Markers，2002;17:189-195

　　2Rudroff C，Striegler S，Schilli M，et al. Thrombin enhances adhesion in pancreatic cancer in vitro through the activation of the thrombin receptor PAR 1. Eur J Surg Oncol，2001;27:472-476

　　3Hu L，Lee M，Campbell W，et al. Role of endogenous thrombin in tumor implantation，seeding and spontaneous metastasis. Blood，2004;104:2746-2751

　　4Rickles FR，Patierno S，Fernandez PM. Tissue factor，thrombin，and cancer. Chest，2003;124 (Suppl 3):58S-68S

　　5Milanini-Mongiat J，Pouyssegur J，Pages G. Identification of two Sp1 phosphorylation sites for p42/p44 mitogen-activated protein kinases: their implication in vascular endothelial growth factor gene transcription. J Biol Chem，2002;277:20631-20639

　　6Berra E，Milanini J，Richard DE，et al. Signaling angiogenesis via p42/p44 MAP kinase and hypoxia. Biochem Pharmacol，2000;60:1171-1178

　　7Huang YQ，Li JJ，Hu L，et al.Thrombin induces increased expression and secretion of VEGF from human FS4 fibroblasts，DU145 prostate cells and CHRF megakaryocytes. Thromb Haemost，2001;86:1094-1098

　　8Tsopanoglou NE，Maragoudakis ME. On the mechanism of thrombin-induced angiogenesis. Potentiation of vascular endothelial growth factor activity on endothelial cells by up-regulation of its receptors. J Biol Chem，1999;274:23969-23976

　　9Tsopanoglou NE，Andriopoulou P，Maragoudakis ME. On the mechanism of thrombin-induced angiogenesis: involvement of alphavbeta3-integrin. Am J Physiol Cell Physiol，2002;283:C1501-1510

　　10Bogatcheva NV，Garcia JG，Verin AD. Molecular mechanisms of thrombin-induced endothelial cell permeability. Biochemistry(Mosc)，2002;67:75-84

　　11Tsopanoglou NE，Maragoudakis ME. Role of thrombin in angiogenesis and tumor progression. Semin Thromb Hemost，2004;30:63-69

　　12Huang YQ，Li JJ，Hu L，et al.Thrombin induces increased expression and secretion of angiopoietin-2 from human umbilical vein endothelial cells. Blood，2002;99:1646-1650

　　13Naldini A，Carney DH，Pucci A，et al.Thrombin regulates the expression of proangiogenic cytokines via proteolytic activation of protease-activated receptor-1. Gen Pharmacol，2000;35:255-259

　　14Browder T，Folkman J，Pirie-Shepherd S.The hemostatic system as a regulator of angiogenesis.J Biol Chem，2000;275:1521-1524

　　15Feng X，Clark RA，Galanakis D，et al. Fibrin and collagen differentially regulate human dermal microvascular endothelial cell integrins: stabilization of alphav/beta3 mRNA by fibrin 1. J Invest Dermatol，1999;113:913-919

　　16Lalla RV，Tanzer ML，Kreutzer DL. Identification of a region of the fibrin molecule involved in upregulation of interleukin-8 expression from human oral squamous cell carcinoma cells. Arch Oral Biol，2003;48:263-271

　　17Palumbo JS，Kombrinck KW，Drew AF，et al.Fibrinogen is an important determinant of the metastatic potential of circulating tumor cells. Blood，2000;96:3302-3309

　　18Palumbo JS，Degen JL.Fibrinogen and tumor cell metastasis. Haemostasis，2001;31(suppl 1):11-15

　　19Kuenen BC，Rosen L，Smit EF，et al.Dose-finding and pharmacokinetic study of cisplatim，gemcitabin，and SU5416 in patients with solid tumor.J Clin Oncol，2002;20:1657-1667

　　20Lee AY，Levine MN，Baker RI. Low-molecular-weight heparin versus coumadin for the prevention of recurrent venous thromboembolism in patients with cancer. N Engl J Med，2003;349:146-153

　　21Zhang W，Chuang YJ，Swanson R，et al. Antiangiogenic antithrombin down-regulates the expression of the proangiogenic heparan sulfate proteoglycan，perlecan，in endothelial cells. Blood，2004;103:1185-1191