Bay 117082增强Fas介导的HL60细胞凋亡作用

　　作者：王利， 刘凌波， 李蕾， 邹萍 作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所，武汉 430022

　　【摘要】 本研究观察NFκB抑制剂Bay 117082对HL60细胞Fas/FasL系统的作用及对Fas介导的HL60细胞凋亡的影响。用RTPCR和流式细胞术检测Bay 117082干预后HL60细胞Fas、FasL和XIAP的mRNA和蛋白表达水平的变化;用ELISA方法检测Bay 117082干预前后sFasL水平的变化;流式细胞术检测Bay 117082干预前后CH11(活性Fas抗体)诱导HL60细胞凋亡的变化。结果表明：用Bay 117082干预后，HL60细胞FasL和XIAP的mRNA和蛋白水平较对照组明显下降，差异具有显著性(p<0.05)，Fas的mRNA、蛋白水平的变化和sFasL水平的变化无显著的差异(p>0.05);Bay 117082干预后HL60细胞对CH11诱导细胞凋亡敏感性显著增强。结论： Bay 117082可能通过下调FasL和XIAP水平增强HL60细胞Fas介导的凋亡。

　　【关键词】 Bay 117082

　　Enhancement of Fasmediated Apoptosis in Leukemic Cell Line HL60 by Bay 117082

　　WANG Li*， LIU LingBo， LI Lei， ZOU Ping

　　Department of Hematology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of science and technology, Wuhan 430022, China

　　Abstract The aim of study was to explore the effects of NFκB inhibitor Bay 117082 on Fas/FasL system and Fasmediated apoptosis in HL60 cells. The mRNA and protein expression levels of Fas, FasL and XIAP after treatment with Bay 117082 were detected by RTPCR and FCM respectively. The level of sFasL was detected by ELISA before and after treatment with Bay 117082; apoptosis was detected by FCM before and after treatment with Bay 117082. The results showed that after treating HL60 cells with Bay 117082, the mRNA and protein levels of FasL and XIAP were lower than that of controls, the difference was significant by statistic analysis (p<0.05). Neither the mRNA and protein levels of Fas, nor the level of sFasL changed significantly (p>0.05). Apoptotic rate of HL60 cells treated with Bay117082 was significantly higher as compared with controls (p<0.05). It is concluded that Bay117082 can enhance Fasmediated apoptosis in HL60 cells by downregulation of FasL and XIAP levels.

　　Key words Bay 117082; Fas/FasL system; HL60; NFκB

　　J Exp Hematol 2007; 15(5):941-945

　　凋亡在肿瘤细胞的发生、发展及抗肿瘤药物耐药中起重要作用。化疗药物可能通过激活Fas途径介导的凋亡治疗肿瘤，但多数白血病细胞系包括HL60都存在Fas途径介导的凋亡抵抗[1]，因此降低甚至逆转其对Fas途径介导的抗凋亡，可为白血病的治疗提供新的思路。近年来研究发现,多种类型白血病细胞中都存在NFκB持续异常活化的现象,而白血病细胞Fas途径的凋亡抵抗与NFκB的异常活化有关[2]。研究证明，抑制NFκB可使淋巴瘤细胞系HuT78、T细胞系H9 等多种肿瘤细胞对Fas途径介导的凋亡敏感性增强[3,4], 但其可能的机制尚不清楚。因此本研究观察NFκB抑制剂Bay 117082对Fas/FasL系统和凋亡抑制蛋白如X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的影响以及Bay 117082干预后HL60细胞对CH11诱导细胞凋亡敏感性的变化，从而阐明其可能的机制。

　　材料和方法

　　主要试剂

　　噻唑兰(MTT)为Sigma公司的产品，Bay 117082为Alexis公司产品，FITC标记的抗Fas单克隆抗体、PE标记的抗FasL单克隆抗体和同型对照为Biolegend公司产品，CH11(activating antiFas)为Upstate公司产品，sFasL ELISA kit为Bender公司产品，cDNA合成试剂盒为Toyobo公司产品，Annexin VFITC试剂盒购于深圳晶美生物工程有限公司，引物在上海生物工程有限公司合成。

　　细胞培养

　　人髓系白血病细胞株HL60由武汉中国典型培养物保藏中心引进，置于含10%胎牛血清(天津三利生物制品研究所产品)的RPMI 1640培养液中，在37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。每天传代1次,生长曲线测试倍增时间为24±1小时，取对数生长期细胞进行实验。

　　取对数生长期细胞，用含10%胎牛血清RPMI 1640培养液调整HL60细胞浓度为1×105/ml，接种96孔培养板，每孔0.2 ml，然后加入用不同浓度的Bay 117082，使Bay 117082终浓度分别为0、2.5、5、10 μmol/L，每组设4个平行孔。空白对照孔只加培养液不加细胞。常规培养24小时后加入MTT工作液(5 mg/ml)，每孔20 μl，37℃孵育5小时，离心后弃上清，加入DMSO，每孔0.15 ml，震荡10分钟使结晶充分溶解，酶标仪570 nm波长检测OD值，根据OD值计算各种浓度下的活细胞百分比。

　　Fas、FasL、XIAP mRNA表达的RTPCR测定

　　收集对照组和Bay 117082(5 μmol/l)作用6小时后的HL60细胞，利用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，紫外分光仪测定RNA浓度。取2 μg RNA使用MMuLV逆转录酶将RNA逆转录cDNA，然后以cDNA为模板，利用各基因的检测引物进行PCR。引物序列、反应条件及产物大小见表1。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶成像系统扫描，以Fas/βactin、FasL/βactin和XIAP/βactin的灰度比值作为Fas、FasL和XIAP的相对表达水平。

　　膜Fas(mFas)、膜FasL(mFasL)检测

　　用流式管收集对照组和Bay 117082(5 μmol/l)作用6小时后的HL60细胞，离心后弃上清, 将细胞悬于100 μl冰预冷的PBS溶液中，计数细胞使细胞数为1×106/test，然后在试验管中加入20 μl FITC抗Fas单克隆抗体和20 μl PE抗FasL单克隆抗体,混匀后避光置冰上孵育30分钟,离心后弃上清，加约4 ml PBS洗去未结合抗体，重悬于300 μl PBS，进行FCM检测。用流式细胞术测定的细胞平均荧光强度表示mFas、mFasL的相对表达强度。

　　可溶性FasL(sFasL)的检测

　　收集Bay 117082干预(5 μmol/l，作用6小时)前后细胞上清，ELISA法定量检测sFasL含量，具体步骤如下：在已包被抗FasL单克隆抗体的96孔板中标准样品孔中加入配制好的标准品溶液每孔100 μl，待测样品孔中加入50 μl/well细胞上清样品和50 μl/well品稀释液，除空白孔外加入生物素化抗体工作液(50 μl/well)，室温下孵育2小时，用洗涤液洗板4次。然后除空白孔外加入酶结合物工作液(100 μl/well)，室温下孵育1小时，用洗涤液洗板4次。然后，在所有孔中加入底物显色剂(100 μl/well)，室温下孵育20分钟，所有孔中加入终止液(100 μl/well)，混匀后即刻测量OD450值。绘制标准曲线,根据标准曲线得出细胞上清sFasL浓度。

　　细胞凋亡的检测

　　实验分为4组：阴性对照组、Bay组、CH11组和Bay联合CH11组。Bay联合CH11组为Bay 117082(5 μmol/l)作用HL60细胞1小时后，加入CH11(20 μmol/l);Bay组、CH11组为分别单用Bay、CH11。于药物处理24小时后收集各实验组细胞，经冷PBS低温(4℃)离心，洗涤细胞2次，将细胞重悬于200 μl 结合缓冲液后，分别加入10 μl annexin VFITC和5 μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟，加入300 μl结合缓冲液，1小时内上机检测细胞凋亡率。

　　统计学处理

　　实验数据以均数±标准差(±SD)表示，两个样本均数的比较采用t检验,两个以上样本的比较采用方差分析(F检验) 。采用SPSS 12.0 for Windows统计软件分析。

　　结 果

　　Bay 117082对HL60细胞增殖的抑制作用

　　如图1所示，Bay 117082对HL60细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性，HL60细胞经0、2.5、5、7.5和10 μmol/l浓度Bay 117082处理24小时后，细胞活率的3次均值分别为97.76%、94.05%、76.96%、55.88%和21.87%。选择5 μmol/L作为Bay 117082的处理浓度。

　　Figure 1. Survival number of HL60 cells detected by MTT after treatment with Bay 117082.

　　Fas、FasL、XIAP 的mRNA水平

　　Bay 117082(5 μmol/l，作用6小时)使HL60细胞FasL和XIAP基因表达水平明显下降，而Fas基因表达强度差异无显著性。对照组Fas/βactin、FasL/βactin和XIAP/βactin的灰度比值分别为0.41±0.10，0.41±0.06，0.33±0.06;实验组Fas/βactin、FasL/βactin和XIAP/βactin的灰度比值分别为0.39±0.09，0.20±0.04，0.13±0.03(图2和图3)。

　　Figure 2. Expression of Fas,FasL in HL60 cells after treatment with Bay 117082. M： DNA marker. Lane 3,4,5,6： Bay 0 μmol/L. Lane 1,2,7,8： Bay 5 μmol/L. Lane 2,4,5,7： βactin. Lane 1,3： Fas. Lane 6,8： FasL.

　　mFas、mFasL表达

　　图4和表2显示对照组和Bay 117082(5 μmol/l)作用HL60细胞6小时后的细胞表面Fas、FasL平均荧光强度，结果和转录水平的变化一致，mFasL平均荧光强度于干预后下降，差异有显著性，而mFas平均荧光强度差异无显著性。

　　Figure 3. Expression of XIAP in HL60 cells after treatment with Bay 117082. M： DNA marker. Lane 1,2： Bay 0 μmol/L. Lane 3,4： Bay 2.5 μmol/L. Lane 5,6： Bay 5 μmol/L. Lane 1,3,5： βactin. Lane 2,4,6： XIAP

　　Figure 4. FCM analysis of Fas and FasL protein in HL60 treated with Bay 117082. 1：control; 2：Bay 117082 0 μmol/l; 3：Bay 117082 5 μmol/l.

　　sFasL水平

　　按ELISA 试剂盒说明书步骤绘制标准曲线，然后分别检测对照组上清sFasL浓度为(0.136±0.017)μg/ L，干预组上清sFasL浓度为(0.131±0.016)

　　Table 2. Expression of mFas and mFasL in HL60 cells of control and experimental group detected by flow cytometry(n=3， ±SD)

　　GuoupMean fluorescence intersityFasFasLControl6.80±1.305.41±1.41Bay 117082 (0 μmol/L)9.98±2.7861.62±2.00Bay 117082 (5 μmol/L)9.92±1.98#51.51±2.11*#p>0.05， compared with group 0 μmol/L， *p<0.01， compared with group 0 μmol/L.

　　μg/ L，两组差异无显著性。此结果说明Bay 117082对HL60细胞上清中sFasL水平无明显影响。

　　细胞凋亡

　　检测结果表明：单用Bay 117082干预组凋亡率为(10.20±0.82)%，单用CH11干预组凋亡率为(11.09±1.11)%,两者合用组细胞凋亡率为(31.25±1.28)%。方差分析提示，合用组凋亡率明显上升，两者有协同作用。

　　讨 论

　　人类白血病的发生和发展与造血细胞的分化受阻及凋亡障碍有关。Fas/FasL系统是研究最深入的介导细胞凋亡的途径，其与白血病的发生、发展和肿瘤细胞的免疫逃逸密切相关[5,6] 。Qin等[2]对Fas途径凋亡抵抗的嗜酸性粒细胞白血病细胞系AML14.3D10进行了研究，发现FasL和Fas结合后可以激活NFκB，使细胞内NFκB异源二聚体p65/p50以时间和剂量依赖的方式向核内移动，抑制NFκB可以使CH11诱导的凋亡明显增加。实验还发现3D10细胞的Fas得到刺激后抗凋亡蛋白CIAP和XIAP水平升高，抑制NFκB后CIAP、XIAP和Bcl2家族蛋白水平都会下降。这些结果说明，嗜酸性粒细胞白血病细胞的凋亡抵抗可能源于NFκB的激活。 Barnhart等[3]对T细胞系H9和B淋巴母细胞系SKW研究发现，用NFκB抑制剂CAPE或Bay 117082都能使这两种细胞对sFasL诱导的凋亡敏感性增加。 Meli等[4]研究发现，使用NFκB抑制剂MG132、PDTC等可以使淋巴瘤细胞对CH11诱导的凋亡显著增强。

　　本实验结果证明，抑制NFκB亦可使HL60细胞系对Fas途径介导的凋亡敏感性增强。本实验还观察了抑制NFκB对HL60细胞Fas/FasL系统和凋亡抑制蛋白XIAP的影响,结果显示Bay 117082使FasL的蛋白和mRNA水平明显下降，推测这与抑制了FasL的转录有关，因为文献证明在活化T细胞及许多实体瘤细胞内，NFκB是FasL高表达的关键正性调控转录因子[7,8]。本实验发现，Bay 117082对HL60细胞Fas的蛋白和mRNA水平无明显影响。 Kim等[1]研究发现，NFκB抑制剂MG132对Fas表达无影响，本实验与文献报道一致。Bay 117082对HL60细胞sFasL水平无明显影响，推测sFasL水平与MMP7而不是NFκB有直接的关系,因为MMP7能够切割mFasL为sFasL。

　　凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein， IAP)是一类在结构上具有同源性的细胞内源性凋亡抑制蛋白家族。人类IAP的主要成员有XIAP、CIAP1、CIAP2、survivin等。XIAP是IAP家族中最有效力的caspase抑制物，其生物学功能多样，对肿瘤发生、发展及预后有多方面的影响。Kater等[9]发现，XIAP抑制剂可以使CLL细胞对Fas介导的凋亡敏感性增强，使用XIAP抑制剂处理后，Fas介导的凋亡可以使caspase 3激活，进而切割PARP并激活caspase 8，进而形成瀑布放大效应使细胞凋亡，这表明XIAP在CD40激活的淋巴细胞对Fas介导的凋亡抵抗中起作用。Doyle等[10]研究发现，HL60表达IAP，分化后IAP的mRNA和蛋白水平均下降;而Ohashi等[11]发现，随着HL60的分化，其对Fas途径介导的凋亡敏感性增强。本实验证实，Bay 117082可使HL60细胞Fas途径介导的凋亡敏感性增强，凋亡抑制蛋白XIAP于Bay 117082抑制后mRNA水平明显下降，推测XIAP水平的降低可能与凋亡敏感性增强相关。

　　综上所述，Bay 117082可能通过降低FasL和XIAP等凋亡抑制蛋白的表达使HL60细胞Fas途径介导的凋亡敏感性增强。这一结果提示，通过抑制NFκB和XIAP的方式诱导白血病细胞的凋亡为白血病治疗提供了一种新的思路，有一定的临床应用前景。

　　【参考文献】

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