B细胞淋巴瘤的抗独特型免疫治疗

　　作者：刘静 作者单位：100034北京大学第一医院血液内科

　　【关键词】 B细胞淋巴瘤 独特型 免疫治疗

　　随着对肿瘤免疫机制的不断了解，肿瘤的免疫治疗逐渐成为人们研究的热点。寻找能够有效激发机体免疫反应的肿瘤特异性抗原是进行免疫治疗的关键。B细胞淋巴瘤在此方面有着特殊的优势，表达于B细胞表面的免疫球蛋白(Ig)可变区的独特型(idiotype,Id)可作为肿瘤特异性抗原，诱导产生抗独特型抗体和/或激活T细胞介导的细胞免疫，从而用于免疫治疗。本文将对B淋巴瘤的抗独特型免疫治疗作一简要综述。

　　1 B细胞淋巴瘤的免疫学特点

　　大多数B细胞肿瘤都是单个克隆的B细胞恶性扩张所致。肿瘤细胞表面表达的Ig分子的可变区具有其独特的构象，称为独特型，他们既可作为抗原识别受体，同时也可作为抗原被其特异性抗体识别。Ig编码基因的重排和体细胞突变决定了Ig具有多样性，使其成为每个B细胞克隆特有的标志。因此当发生某个B细胞克隆恶变后异常增生，其独特型就可作为肿瘤特异性抗原，通过诱导产生抗独特型的抗体和/或激活T细胞介导的细胞免疫有可能达到治疗效果。以往对独特型的研究重点主要在其互补决定区(complementarity determining regions, CDR区)，近年来，许多研究表明框架区(framework region,FR区)在抗独特型的免疫应答中可能起着重要的作用。

　　2 独特型蛋白疫苗

　　Lynch和Eisen最早将Id蛋白疫苗应用到多发性骨髓瘤小鼠模型BALB/c上[1]，发现可以诱发小鼠的抗肿瘤免疫，并且具有特异性。随后George等也在BCL1淋巴瘤小鼠模型上证实了Id蛋白疫苗可以诱发特异性的抗淋巴瘤免疫反应[2]。但是其免疫原性较弱，偶联具有较强免疫原性的载体蛋白及佐剂成为增强其免疫反应的必要条件。Levy实验组将Id与KLH(keyhole limpet hemicyanin)载体偶联免疫38C13淋巴瘤小鼠[3]，发现可以诱导较强的保护性免疫反应。该实验组还对9例滤泡性淋巴瘤患者进行了临床试验[4]。这9例淋巴瘤患者均处于完全缓解期或是微小残留期，给他们注射了自体纯化的IdKLH偶联体和化学佐剂的混合物后，7例患者观察到了特异性的抗Id的抗体或细胞免疫反应，2例由微小残留转成完全缓解，证明了IdKLH偶联体和化学佐剂混合物可以成功诱导较强的抗Id免疫反应。随后得到的结果更验证了IdKLH偶联体的疗效[5]。在对41例处于化疗后缓解期的低度非霍奇金淋巴瘤患者进行同样的长期IdKLH偶联体治疗中，20例患者产生了特异性的抗Id免疫反应，与未进行IdKLH偶联体治疗的患者相比，这些患者维持缓解状态的平均时间从1.3年延长到7.9年，充分证明了IdKLH偶联体的较强的免疫原性以及成功诱导抗Id免疫反应的能力。

　　化学佐剂虽然能辅助Id激活免疫反应，但并不是所有的佐剂都适用于人体试验，如完全福氏佐剂就不适用于临床。一些细胞因子具有激活APC，增强其处理和呈递抗原的能力并促进其与相应T细胞相互作用的功能，故用细胞因子代替化学佐剂可能发挥更好的辅助作用。GMCSF就是最常用的细胞因子之一。Tao等[6]将GMCSF的编码序列连接在Id的编码序列上，表达了重组融合蛋白IdGMCSF。并用IdGMCSF(包括小鼠和人的GMCSF)，Id+GMCSF，IdKLH，Id几种蛋白或蛋白混合物分别免疫38C13小鼠，IdKLH和IdGMCSF(鼠的)融合蛋白免疫的小鼠则均产生了抗Id抗体，并且IdGMCSF(鼠的)融合蛋白诱导产生的抗Id抗体滴度更高、时间更长。Kwak等[7]将GMCSF与IdKLH偶联体一同注射给38C13小鼠，与只注射IdKLH偶联体相比，能诱导明显提高的抗Id免疫。并且由于GMCSF的应用，使以T细胞为主的细胞免疫明显增强。Bendandi等[8]将GMCSF与IdKLH偶联体一起对处于完全缓解状态的20位滤胞性淋巴瘤患者进行了临床试验，其中11位可检测到染色体易位。注射疫苗后，8位患者的染色体易位消失了，19位体内发现了相当多的细胞因子如TNF、IFNr等的分泌，并且随Id疫苗剂量的增加而分泌量增多，而至少三位患者体内未观察到抗体的反应，提示特异性的T细胞在抗Id的免疫中发挥了主导作用，而不是依赖于抗体的作用。这在以前未加入GMCSF的实验中，是从未观察到的，说明了GMCSF在激活T细胞方面发挥着重要的作用。

　　随后，又有人将细胞毒性T细胞抗原4(CTLA4)与Id构建了融合蛋白Id CTLA4[9]。用微量IdCTLA4(<0.1μg)免疫38C13小鼠，就可产生高水平的抗体及促进T细胞增殖，其效应与IdGMCSF不相上下，成为不同于IdGMCSF的另一种新型高效融合蛋白疫苗。由于两者作用于不同的两个方面，而最终均通过APC发挥作用，因此将二者联合应用也许会有意想不到的效果。

　　3 抗原肽负荷的DC作为疫苗

　　除了通过载体、佐剂和细胞因子等增强Id的免疫原性外，直接用Id体外与自体DC细胞一起孵育，激活DC细胞，上调各种膜表面活性分子表达，然后回输，也能有效诱导机体产生特异性的抗Id免疫。Hsu等[10]将纯化的Id蛋白与自体外周血淋巴细胞分离的DC共同孵育,然后经静脉回输给恶性B细胞淋巴瘤患者。结果治疗的4例患者均产生了可检测到的抗Id的T细胞免疫反应，并且2例完全缓解,1例部分缓解。为增强IdDC的免疫原性，Timmerman和Levy[11]用IdKLH体外刺激DC,回输给小鼠，诱导了高效的抗Id的免疫反应。随后该实验组又报道了35位恶性B细胞淋巴瘤患者分别接受IdDC和IdKLHDC治疗的结果[12]。在接受IdDC治疗的22位患者中，有13位出现了抗Id的T细胞增殖，2位观察到抗Id抗体的分泌。为提高体液免疫的作用，后13位接受了IdKLHDC治疗，4位出现了抗Id的T细胞反应，6位出现了高水平的抗Id抗体，这些抗体表现出对自体Id抗原的高亲和力和高特异性。最后，对注射DC疫苗后仍病情持续或复发的患者进行了IdKLH和佐剂增强疫苗注射，3位分别出现Id的T细胞反应或抗Id抗体，其中2位完全缓解，1位缓解程度增强。提示无论DC疫苗是否发挥了抗肿瘤作用，IdKLH均能够增强机体的抗肿瘤免疫。随着对DC细胞的进一步研究，以及DC细胞分离培养技术的提高，DC疫苗将有更大的发展潜力。

　　4 抗淋巴瘤DNA核酸疫苗

　　虽然Id蛋白疫苗在多个B淋巴瘤动物模型和临床试验中都能有效诱导机体特异的抗肿瘤免疫反应，但是，应用Id蛋白疫苗治疗的最大的难题就是Id的获取和纯化。尽管肿瘤细胞表面有Ig的表达，但表达量很弱，直接提纯十分困难。而基因克隆技术的进步使DNA疫苗很容易获得。Syrengelas等[13]将包含Id编码序列和人Ig恒定区序列，以及GMCSF编码序列的质粒注射给38C13小鼠，发现单独的Id DNA疫苗不能产生抗肿瘤免疫反应，只有与人Ig恒定区序列融合的DNA疫苗才能诱导特异性的抗体介导的保护性免疫反应。加入GMCSF编码序列可以增强该融合DNA疫苗的抗肿瘤作用。在此实验基础上，Timmerman等[14]将Id与小鼠的Ig恒定区序列融合共同构建的DNA疫苗应用到缓解期的淋巴瘤患者身上。大部分患者出现了抗鼠成分免疫反应，大约一半患者也出现了抗自身Id的免疫反应，但是并不具有严格的Id特异性，未出现明显的毒副作用。GMCSF编码序列的加入不能改变上述反应。可见DNA疫苗还需通过优化疫苗剂量、给药途径、载体设计及初次免疫时间等条件来改善其治疗效果。无论如何，DNA疫苗以其操作简单、灵活、安全成为抗Id治疗的一个很有吸引力的发展方向。

　　另一种方式构建的Id DNA疫苗是将Ig的重链和轻链可变区基因(Vh和VL)用一个连接子连接起来，形成单链可变区片段(singlechain Fv fragment, scFv)，然后克隆到质粒中[15]。scFv是维持其抗原结合能力的最小结构，其与抗原的亲和力与天然抗体相似，含有Ig所有的的抗原决定簇，能与抗Id抗体结合。但是在小鼠模型上，单独的scFv 却不能诱导有效的抗Id抗体反应[16]。为了发挥其潜能，King等[17]把scFv基因与无毒的破伤风毒素C片段(FrC)的融合基因scFv FrC。FrC结构域中包含一个能与鼠或人的MHCⅡ类分子结合的表位，能促进CD4+T细胞的识别和杀伤。实验结果表明scFv FrC 融合DNA疫苗能有效的介导抗肿瘤免疫。更重要的是，无论表面Ig阳性还是Ig阴性的肿瘤细胞都能被该融合疫苗抑制，由于抗Id的抗体只对Ig阳性肿瘤细胞有较强的抑制作用，显然，CD4+T细胞介导的抗肿瘤机制在此发挥了重要作用。他们随后又发现[18]，在FrC的第2个结构域中，包含两个CD8+T细胞的表位，这两个表位跟肿瘤抗原竞争CTL细胞，使抗FrC的CTL增多，而在一定程度上抑制了抗肿瘤CTL细胞的产生。将第2个结构域去除后，诱导产生的抗Id的CTL细胞活性可提高2～3倍。这一发现为制备更有效的DNA融合疫苗提供了新的思路。

　　5 T细胞介导的免疫治疗

　　目前的免疫学理论认为，抗体并不是抗肿瘤免疫的主力军。而T细胞介导的细胞免疫在抗肿瘤免疫中发挥着主要作用。在缺乏抗体的情况下，T细胞仍能产生Id特异性的保护性免疫反应[19]。加入细胞因子、Id负荷DC等方式可以诱导增强T细胞介导的抗肿瘤作用。以往认为这些特异性反应多是针对Ig的CDR区。而Trojan等[20]在测定192例淋巴瘤患者的Ig重链可变区(IgHV)序列时发现，有相当多的T细胞表位位于框架区，而不是CDR区。他们用HLAA*0201阳性B淋巴瘤患者的免疫球蛋白可变区的抗原肽加载CD40活化的B细胞作抗原呈递细胞，重复刺激HLAA*0201阳性正常供者的CD8+T细胞。1条CDR区肽和9条FR区肽诱导出特异性CTL细胞。说明该10条肽能够与HLAA2结合，形成的复合物能够被TCR识别。从而证实免疫球蛋白重链可变区含有T细胞表位，而且绝大部分位于框架区。5条FR区肽诱导出的CTL细胞系具有抗慢性淋巴细胞白血病(CLL)的作用，而CDR区肽诱导的CTL细胞系无此作用。提示框架区的T细胞表位能够被恶性B细胞自然呈递。

　　随后，Trojan等[21]又对其中18条FR区肽与HLAA2结合的1～2个保守氨基酸进行了替换，以提高其免疫原性。结果显示，其中17条替换肽与HLAA2结合力明显高于相应初始肽，16条替换肽诱导CTL细胞杀伤靶细胞能力明显高于初始肽。同时，替换肽诱导产生的CTL细胞还能杀伤初始肽加载的靶细胞。更重要的是，替换肽诱导产生的CTL细胞还能杀伤表达初始肽的CLL的肿瘤细胞，其杀伤力明显高于初始肽诱导产生的CTL细胞。提示改变1～2个保守氨基酸后的FR区肽能明显提高CTL细胞的杀伤作用。

　　本室发现[22]框架区的可以诱发抗淋巴瘤的免疫反应一些抗原9肽是其所属IgH基因家族所共有的。根据Ig框架区的不同可以把淋巴细胞或淋巴瘤细胞分成7种基因家族，每种基因家族的淋巴细胞都有家族特异的框架区抗原9肽，用含有这些9肽的正常人的胚系基因作为DNA疫苗肌注小鼠，这些胚系基因与淋巴瘤的FR区相同CDR区不同,能诱发抗属于同一基因家族的淋巴瘤和正常B细胞的免疫应答[23]，提示Ig框架区在抗独特型的免疫应答中可能起着重要的作用。进一步[24]用IgHV1家族的一条9肽反复刺激正常人外周血单个核细胞，观察到明显的CD8+T细胞增殖，并能杀伤肽负荷的T2细胞。框架区存在T细胞表位，并能诱导特异性CTL细胞活化和增殖，为B细胞肿瘤疫苗的制备提供了新的思路。由于Ig不同基因家族的框架区相对保守，具有相似的序列和结构，因此将框架区T细胞表位肽制成疫苗，将使淋巴瘤属于同一基因家族的患者都能应用同一种疫苗治疗，而不需为每一位患者独自制备CDR区的独特型疫苗。既节省了大量的时间和人力物力，又为每位患者提供了彻底治愈淋巴瘤的机会。因此本实验室[25]克隆了其中两个家族的IgH框架区基因片段，构建了他们与IL2的共表达载体，作为家族特异性抗淋巴瘤疫苗注射给小鼠，观察到两种IgH框架区基因片段及与他们与IL2的共表达载体均可以使小鼠产生抗同一家族淋巴瘤细胞的特异性抗体，IL2连接组免疫动物所产生的抗体滴度更高。此外，连接IL2的表达载体免疫动物还可以增强被免疫动物的IFNγ分泌，从而有可能通过IFNγ进一步起到抗肿瘤的作用。由于同一基因家族的正常淋巴细胞与淋巴瘤细胞有相同的Ig框架区，所以Ig框架区诱导的免疫反应也会作用与这些正常淋巴细胞，但与肿瘤恶性进展相比，副作用有限。IgHV家族特异性基因疫苗调控某一群淋巴细胞生长的功能还可能有其它应用潜力。

　　虽然目前免疫治疗还只能作为化疗，骨髓移植等治疗B淋巴瘤的一种辅助手段，但是随着对Ig独特型结构的进一步研究、各种分子生物学技术的发展以及更多临床试验结果的支持，免疫治疗将成为治疗B淋巴瘤，尤其是肿瘤缓解后治疗微小残留病的主要方式之一。

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