BP1基因在急性白血病患者中的表达及相关研究

　　作者：徐桂峰，徐开林，潘秀英 作者单位：1.丰县人民医院血液科，江苏丰县221700;2.徐州医学院附属医院血液科，江苏徐州221002

　　【摘要】 目的 探讨BP1基因在急性白血病患者中的表达及其临床意义。方法 运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测HEL白血病细胞系(BP1阳性细胞株)、92例急性白血病(AL)患者及10名正常对照者BP1基因的表达水平;分析其在急性白血病中的表达规律及与临床预后的关系。 结果 10名正常人和急性淋巴细胞白血病患者的骨髓细胞中无BP1基因表达(阴性);HEL细胞系BP1阳性;急性髓系白血病(AML)患者BP1基因总阳性率42.59%，在各亚型AML中均表达，AML各亚型间的阳性率无差异(P>0.05)。AML初治、复发、完全缓解的BP1基因阳性率分别为50.00%、46.15%、11.11%，各组间无明显差异(P>0.05)。AML初治患者中BP1阳性表达者首次完全缓解(CR1)后缓解持续时间短于BP1阴性表达者(P<0.01)，早期病死率(确诊后3个月内死亡)明显升高(P<0.01)。结论 BP1基因在AML中有异常高表达，具有髓系特异性，可作为区别淋系和髓系的标志性基因。BP1基因在AML的发病中可能起一定作用，可作为判断AML预后的一个指标。

　　【关键词】 急性白血病;BP1基因;基因表达

　　The expression of BP1 in acute leukemia and its significance

　　XU Guifeng1, XU Kailin2, PAN Xiuying2

　　(1.Department of Hematology, People′s Hospital of Fengxian County, Fengxian, Jiangsu 221700, China;

　　2. Department of Hematology, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract: Objective To investigate the expression of BP1 gene in patients with acute leukemia and its significance. Methods BP1 level was determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in HEL leukemia cell line in 92 patients with acute leukemia and 10 healthy volunteers. The regularity of the expression of BP1 gene in acute leukemia and the relationship between BP1 level and prognosis of leukemia was explored. Results BP1 mRNA was not expressed in 10 healthy volunteers and patients with acute lymphoid leukemia, while it was positive in HEL cell line. The total positive rate of BP1 gene expression in AML was 42.59%. BP1 gene was expressed in all subtypes of acute myelogenous leukemia, with no marked difference (P>0.05). The positive rate was 50.00% for the newly diagnosed, 46.15 % for those with relapse and 11.11% for those with complete remission. There were no significant differences in positivity among groups (P>0.05). The remission phase after CR1 was shorter in BP1 (+) patients than in the (-) ones, and the early mortality rate was higher in the former than in the latter (P<0.01). Conclusion BP1 was abnormally overexpressed in acute myelogenous leukemia, which suggests that it is myelogenous specific and could serve as a marker gene to distinguish myelogenous and lymphoid genes. BP1 gene may play an important role in the pathogenesis of some myeloid malignancies and serve as an index to AML prognosis.

　　Key words: acute leukemia; BP1 gene; gene expression

　　同源盒基因是一组转录调控基因，以种系特异性和阶段特异性的方式在造血增殖分化和胚胎发育中起调控作用[1]。BP1基因定位于17号染色体q21-22，近邻HOXB族，且位于3′端[2]，为一原癌基因，理论上参与较早期的造血干祖细胞的分化。国内外资料表明，BP1基因与髓系恶性血液病的发生相关，但尚缺乏深入研究。本实验用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测BP1在不同类型急性白血病患者中的表达，探讨其在急性白血病发病及预后等方面的意义。

　　1 资料和方法

　　1.1 研究对象

　　1.1.1临床病例 收集2005年6月—2007年2月间徐州医学院附属医院血液科住院的急性白血病(AL)患者92例，男性58例，女性34例，男∶女=1.71。年龄10岁～72岁，平均(38.58±8.24)岁。全部标本经骨髓细胞形态、组化及免疫表型检测，符合FAB诊断标准。92例AL中急性淋巴细胞白血病(ALL)38例，急性髓系白血病(AML)54例(M1 8例 ，M2 17例，M3 8例，M4 5例，M5 13例，M6 2例,M7 1例)。初治58例，复治20例，缓解后14例。所有被观察的AML初治患者均接受标准的柔红霉素+阿糖胞苷(DA)、高三尖杉酯碱+阿糖胞苷(HA)、米托蒽酯+阿糖胞苷(MA)等方案诱导缓解治疗。M3患者主要应用维甲酸及(或)亚砷酸治疗。ALL采用长春新碱+柔红霉素(环磷酰胺)+左旋门冬酰胺酶+泼尼松或长春新碱+米托蒽醌(环磷酰胺)+左旋门冬酰胺酶+泼尼松方案。

　　1.1.2 对照组 正常对照组10例，男性6例，女性4例，平均年龄(30.62±6.80)岁。均为正常献血员。

　　1.1.3 BP1基因阳性细胞株 HEL细胞系均购自中国医学科学院上海细胞所。

　　1.2 主要试剂和仪器 Trizol试剂、Tag酶、6-merprimers、dNTPs(SANGO公司)，M-MLV逆转录酶(Promega公司)，DEPC(AMRESCO公司)，DNA Ladder(MBI公司)，9600 PCR基因扩增仪(PE公司)，凝胶成像系统(美国UVP公司)，PCR引物由GIBCO公司及上海生工合成。

　　BP1引物序列(扩增产物581 bp):

　　上游： 5′-CACCTCCTGTCTTACCCCTACACC-3′;

　　下游：5′-GCCCTTCCCCAGATACACATCTAG-3′;

　　内对照GAPDH引物(扩增产物306 bp)：

　　上游：5′-CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT-3′;

　　下游:5′-AGCCTTCTCCATGGTGAAGAC-3′。

　　1.3 实验方法 BP1基因检测采用RT-PCR方法。

　　1.3.1 单个核细胞(MNC)分离 取外周血5 ml或骨髓液2 ml，肝素抗凝，用Ficoll淋巴细胞分离液3 ml分离出单个核细胞，用1×PBS洗涤2～3次，-80℃保存备用或直接提取(取5×107个MNC用于细胞总RNA提取)。HEL细胞采用DMEM培养液常规培养，收集HEL细胞，PBS洗涤2次，取1×107个细胞用于提取RNA。

　　1.3.2 总RNA提取 采用Trizol试剂一步法提取总RNA。参照说明书进行骨髓单个核细胞RNA抽提，所抽提总RNA经分光光度计测定光密度，D260/D280值在1.85～1.98者用于提取RNA。

　　1.3.3 cDNA第1链合成 40 μl反应体系包括：4 μl总RNA，5×逆转录缓冲液8 μl，2.5 mmol/L dNTP 6 μl,20 μmol/L 6-merprimers 5 μl,300 μmol/L MLV。37℃、60 min;95℃、5 min 灭活逆转录酶。

　　1.3.4 PCR反应 50 μl BP1反应体系包括：cDNA 8 μl，10×PCR缓冲液5 μl ，25 mmol/L MgCl 23 μl,上、下游引物各5 μl ，2.5 mmol/L dNTP 2 μl ，Tag酶0.5 U，补双蒸水至50 μl。扩增条件：94℃预变性5 min;94℃变性60 s;60℃退火1 min, 72℃延伸2 min;循环35次后72℃延伸8 min。

　　1.3.5 PCR产物凝胶电泳 PCR产物及内对照各4 μl加上2 μl溴芬兰上样缓冲液混匀，加样于2%琼脂糖凝胶上，以100 bp Ladder DNA marker同时加样作为标志。80 V恒压，电泳60 min，EB染色，在UVP凝胶成像系统下摄片。

　　1.4 病例随访 在采集标本的同时详细收集患者的临床资料及随访联系方法，通过门诊、电话、信访等多种途径进行随访。

　　1.5 统计学处理 t检验、χ2检验、秩和检验。应用SPSS 11.5软件包进行数据处理。检验水准：α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 对照组BP1基因的表达 10例正常人及38例ALL患者骨髓单个核细胞中无BP1基因的表达(阴性)，HEL细胞系BP1基因表达阳性。电泳结果见图1。

　　图1 正常人骨髓、外周血、完全缓解患者、

　　ALL患者骨髓BP1基因的表达

　　1：正常人骨髓;2：正常人外周血;3、4：完全缓解患者;5：ALL患者骨髓;M：100 bp DNA marker2.2 AML不同FAB分型中BP1基因的表达 GAPDH 特异扩增条带306 bp，BP1引物由于跨越了一个可变性剪接位点而产生了2个PCR产物(201 bp和380 bp)，见图2。由表1可见，AML各亚型间BP1基因表达的阳性率无显著差别(P>0.05)。表1 BP1基因在AML各个亚型中的表达

　　AML各亚型间BP1基因表达的阳性率无显著差别，P>0.052.3 BP1基因表达与AML临床特征的关系 由表2可见， AML中BP1基因阳性表达与性别、年龄、白细胞数、完全缓解有关:男性患者BP1基因的阳性表达高于女性，两者有显著性差异(P<0.05);年龄>45岁表达高(P<0.05);白细胞>100×109/L时BP1基因表达高(P<0.05);BP1阳性表达组比阴性组完全缓解率(CR)低(P<0.05)。与骨髓原始、幼稚细胞数及CD34是否阳性无关(P>0.05)。

　　2.4 AML初步随访结果 32例初治患者中BP1基因表达阳性16例(50.00%);13例复发患者中有6例(46.15%)BP1基因阳性;9例完全缓解患者1例(11.11%)BP1基因阳性。复发患者BP1基因表达(46.15%)与初治患者表达(50.00%)无显著的差异(P>0.05)。部分初治、复发病例的电泳结果见图3。表2 AML患者BP1基因表达与临床特征的关系

　　PR：部分缓解;CR：完全缓解;NR：未缓解。WBC为非正态分布数据，加用秩和检验Z值为-4.049，P<0.05有统计学意义。*：自完全缓解后开始计算，随访截至2007年2月28日。#:初诊后开始计算，生存期≤3个月

　　由表2可见：23例BP1阳性的AML患者经DA、MA或HA标准化疗1～2个疗程，M3患者经亚砷酸或维甲酸诱导治疗1～2个月，9例达完全缓解，完全缓解率9/23(39.13%)与BP1阴性者23/31(74.19%)相比有显著的差异性。BP1阳性患者生存期较BP1阴性患者生存期短，但统计学上无显著性差异(P>0.05)。初治组BP1阳性的AML患者与BP1阴性者相比，CR后持续缓解时间短(P<0.01)，自缓解后3个月内早期病死率明显升高(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　同源盒基因家族是一类在进化过程中高度保守的基因，均含有一个183个核苷酸序列编码的同源蛋白作为转录因子起调节作用，是胚胎发育、细胞分化转录过程中的主控基因。同源盒基因首先发现于果蝇体内，具有高度保守性，在人类称HOX基因。研究表明HOX基因与造血调控密切相关。例如，HOXB2、B4、HOXC6、C8与红系调节有关，HOXA9、A10则于粒单系发育有关[3]。本实验采用敏感度高的RT-PCR方法检验发现，在正常骨髓及成熟的外周血细胞中无BP1基因表达。提示：BP1基因在较晚期的造血细胞及成熟血细胞中没有表达。故推测BP1表达发生在早期干细胞阶段，随细胞成熟分化表达量渐下降。Chase等[4]观察到：在MB-02细胞系经促红细胞生成素(EPO)刺激后开始分化，开始分化时BP1表达量开始下降，第4天已不能检测出，也证实了这一点。表明BP1的表达在AML形成中起了重要作用。

　　本实验观察了BP1的表达与AML预后间的关系，发现BP1表达是否阳性虽与临床缓解率无关，但BP1阳性的患者与BP1阴性的患者相比，CR后持续缓解时间短，早期死亡率高。提示BP1阳性的患者复发率高，近期疗效差，生存期短。BP1的高表达可能是AML患者预后不良的一个因素。

　　虽然BP1基因表达不能作为影响AML预后的惟一因素，但本研究结果提示：在同样使用标准诱导方案(如DA、HA、MA)时，BP1基因表达阳性组患者的缓解率明显低于基因表达阴性组患者。同时，我们调查了BP1基因表达与生存期的关系，虽然BP1基因表达阳性组患者生存期短，但没有统计学意义，这可能与影响AML预后因素多、样本量小以及随访时间短有关。

　　同源盒基因还与多种肿瘤的发生有关，研究表明：在转录过程中，同源盒基因的激活或阻遏可导致白血病的发生。HOX基因在早期造血组织中常有表达。HOX基因的异常表达或因融合基因的持续激活的同源结构域导致下游靶基因的持续激活。这些永久性信号可阻止细胞的分化或导致造血前体细胞的大量增殖。其中HOXA5表达的丧失已被证实是乳腺癌发生的一个重要步骤[5]。BP1作为HOX基因的一种，同样可能参与肿瘤的形成：将DLX基因导入K562细胞，发现其在软琼脂上的克隆形成能力显著增加(达45倍)，而克隆形成能力则是致瘤潜能的标志。为此，我们研究了BP1基因与急性白血病的关系，结果表明BP1基因在AML各型中均有表达，而在ALL中均无表达，此结果与Shimamoto等[6]研究结果有异。Shimamoto等的研究认为BP1 在T-ALL中阳性率为32%，在B-ALL中不表达，有待进一步深入分析。可以推断：BP1可能是一种原癌基因，正常情况下在特定阶段出现瞬时表达，调节造血细胞的分化，当由于某种原因使得BP1过度表达时，则可导致肿瘤的发生。因而提示：BP1具有髓系特异性，可作为区别淋系和髓系的标志性基因。

　　综上所述，BP1基因是一种原癌基因，在AML中有异常高表达，具有髓系特异性，可作为区别淋系和髓系的标志性基因;在AML的发病中可能起一定作用，可作为判断AML预后的一个指标。

　　【参考文献】

　　[1] Sauvageau G, Lansdorp PM, Eaves CJ, et al. Differential expression of homeobox genes in functionally distinct CD34+ subpopulations of human bone marrow cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA,1994，91(25):12223-12227.

　　[2] Fu S, Stevenson H, Strovel JW, et al. Distinct functions of two isoforms of a homeobox gene, BP1 and DLX7, in the regulation of the β-globin gene [J].Gene,2001，278(1-2):131-139.

　　[3] van Oostveen J, Bijl J, Raaphorst F, et al. The role of homeobox genes in normal hematopoiesis and hematological malignancies [J]. Leukemia,1999,13(11):1675-1690

　　[4] Chase MB, Fu S, Haga SB, et al. BP1, a homeodomain-containing isoform of DLX4, represses the β-globin gene [J].Mol Cell Biol,2002,22(8):2505-514.

　　[5] Raman V, Martensen SA, Reisman D, et al. Compromised HOXA5 function can limit p53 expression in human breast tumours [J].Nature,2000,405(6789):974-978.

　　[6] Shimamoto T, Nakamura S, Bollekens J, et al. Inhibition of DLX-7 homeobox gene causes decreased expression of GATA-1 and c-myc genes apoptosis [J]. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(7):3245-3249.