整合素α５β１介导的粘着斑激酶和细胞外信号调节激酶信号传导通路对Ｋ５６２细胞增殖的影响

　　作者：牛志云，成志勇，刘英杰，索晓惠，张学军，潘崚 作者单位：北医科大学第二医院血液内科， 河北 石家庄 050000; 2. 保定市第一医院血液内科， 河北 保定 071000;3. 石家庄市第三医院 内八科， 河北 石家庄 050011; 4. 邯郸市第一医院血液内科， 河北 邯郸 056002

　　【摘要】 分析整合素α5β1介导的粘着斑激酶(FAK)和细胞外信号调节激酶(ERK)信号转导通路对K562细胞增殖的影响，并初步探讨其作用机制。 【方法】 应用四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)检测抗整合素α5β1单抗(Anti-α5β1)对K562细胞增殖的抑制作用，应用反转录PCR(RT-PCR)和蛋白印迹(western blot)方法检测FAK和ERK的mRNA和蛋白表达水平的改变。【结果】 Anti-α5β1明显抑制K562细胞的增殖，下调细胞内总FAK及ERK的mRNA和蛋白表达，并抑制其磷酸化水平。【结论】 整合素α5β1介导的FAK-ras-ERK信号转导通路可能参与了K562细胞的增殖调控，阻断此通路可明显抑制K562细胞的增殖。

　　【关键词】 整合素; K562细胞; 粘着斑激酶; 细胞外信号调节激酶

　　Effect of Integrin α5β1-mediated FAK and ERK Signal Pathwayn Proliferation of K562 Cells　NIU Zhi-yun， CHENG Zhi-yong， LIU Ying-jie， SUO Xiao-hui， ZHANG Xue-jun， PAN Ling1. Department of Hematology， Thef Hebei Province， Shijiazhuang 050000， China; 2. Department of Hematology， The First Hospital of Baoding 071000， China;

　　3. Department of The 8th Internal Medicine， The Third Hospital of Shijiazhuang， Shijiazhuang 050011， China;

　　4. Department of Hematology， The First Hospital of Handan， Handan 056002， China)

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the function of integrin α5β1?鄄mediated focal adhesin kinase (FAK) and extracellular signal-regulated kinase (ERK) signal transduction pathway on the proliferation of K562 cells and explore its mechanism. 【Methods】 The inhibitory effect of anti-α5β1 on the proliferation of K562 cells was measured by MTT assay， the expression levels of FAK and ERK mRNA by RT-PCR. The protein expression levels of FAK and ERK were detected by western blot analysis. 【Results】 The present study showed that anti-α5β1 antibody could inhibit the proliferation of K562 cells， down-regulate the expression of total FAK and ERK mRNA and the relative proteins. 【Conclusion】 Intergrin α5β1 mediated FAK-ras-ERK signal transduction pathway might conduct the abnormal proliferation of K562 cells.

　　Key words： integrin; K562; FAK; ERK

　　整合素是一类重要的细胞表面受体，它作为一种跨膜信号分子，通过特有的信号转导途径传递相关信号，参与调节细胞的多种生理和病理变化。研究表明，整合素β1亚家族(主要包括α5β1和α4β1)大量表达于慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)祖细胞上，但由于其功能存在缺陷而导致细胞异常增殖和黏附功能下降。国内外研究表明[1-2]抑制CML细胞特异性P210蛋白表达可恢复整合素β1介导的CML造血祖细胞的黏附和增殖抑制作用，CML和人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞中P210蛋白的酪氨酸激酶活性异常增高可能是由于表达P210蛋白的细胞中整合素β1活化障碍所引起。研究证实，应用整合素介导的信号转导通路中某些关键分子如粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)、细胞外信号调节激酶(signal-regulated kinase，ERK)的抑制剂或抑制性抗对抑制肿瘤细胞的增殖有一定作用[3-4]。因此本文以K562细胞为研究对象，观察整合素α5β1单克隆抗体对K562细胞增殖及FAK、ERK表达的影响，并与CML的常用药物IFNα-2b的作用进行比较，探讨整合素介导的FAK-ras-ERK信号通路在CML细胞异常增殖中作用以期为CML的治疗提供新的靶向治疗。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞培养

　　K562细胞、10例健康志愿者骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells， BMMNC)和10例CML急变期患者的BMMNC在含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基中于37 ℃、体积分数5%CO2及饱和湿度下培养。收集对数生长期K562细胞，调整细胞密度为5 × 106细胞/mL，以每孔1.0 mL接种于24孔板，参照文献[5]以终浓度为10 000 U/mL 的IFNα-2b和4 μg/mL整合素α5β1单抗(Anti-α5β1)预处理各组细胞48 h。

　　1.2 药品和试剂

　　阻断型小鼠抗人整合素α5单克隆抗体(Anti-α5，小鼠IgG1)为BD pharmingen 公司产品，阻断型小鼠抗人整合素β1单克隆抗体(Anti-β1，小鼠IgG1)，购自苏州库尔特公司。IFNα-2b购于诺华公司。小鼠抗FAK单克隆抗体、兔抗p-FAK(Tyr397)多克隆抗体、兔抗ERK1多克隆抗体和小鼠抗p-ERK单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。Trizol RNA 提取试剂盒购自Gibco公司，随机引物、M-MLV逆转录酶及TaqDNA聚合酶、dNTP等PCR反应体系购自Promega公司。FAK和ERK引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

　　1.3 流式细胞仪检测整合素α5β1表达水平

　　分别收集培养液中加入抗整合素α5(CD49e)单抗或抗整合素β1(CD29)单抗或对照抗体(小鼠IgG同型对照抗体)后培养的K562细胞、健康志愿者BMMNC和 CML急变期患者的BMMNC，并调整细胞密度为5 × 106/mL，取细胞悬液100 μL，分别加入羊抗鼠FITC二抗10 μL，4 ℃避光放置30 min;冷PBS洗涤后，用FCM检测K562细胞、健康志愿者BMMNC以及CML患者的BMMNC表面整合素α5、β1的表达情况。

　　1.4 MTT检测Anti-α5β1对K562细胞增殖的影响

　　收集对数生长期的K562细胞并调整密度为5 × 106/mL，将细胞悬液接种于96孔培养板，每孔200 μL，实验组分为IFNα-2b组、Anti-α5β1组和IFNα-2b + Anti-α5β1组;对照组加入同型对照抗体(小鼠IgG)孵育。实验组IFNα-2b终浓度为10 000 U/mL，Anti-α5β1浓度分别为3 μg/mL，4 μg/mL和8 μg/mL，每组接种3个复孔连续培养1 ～ 6 d。培养结束前4 h每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，离心弃上清，加入200 μL二甲基亚砜(DMSO)充分溶解结晶物，采用酶标仪检测490 nm处吸光度A值，绘制细胞存活曲线并计算增殖抑制率。

　　1.5 PT-PCR检测FAK和ERK mRNA水平

　　分别收集对照组、Anti-α5β1和IFNα-2b处理48 h的K562细胞以及CML急变期患者和健康志愿者的BMMNC，以TrizolRNA提取试剂盒提取细胞总RNA。引物序列及扩增片段如下：β-actin上游引物5′-TCA TCA CCA TTG GCA ATG AG-3′，下游引物5′-CAC TGT GTT GGC GTA CAG GT-3′;扩增片段长度155 bp。FAK上游引物5′-TTG CGG AGA ATA TGG CTG ACC TAA-3′，下游引物，5′-TGG TAT TGA TGG CAA AGC CCG TTC-3′;扩增片段长度116 bp。ERK1上游引物5′-ACC TGC TCA TCA ACA CCA CC-3′，下游引物，5′-CGT AGC CAC ATA CTC CGT CA-3′;扩增片段长度110 bp。反应条件：94 ℃预变性2 min进入循环，94 ℃变性40 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，经35个循环扩增后72 ℃延伸10 min。

　　1.6 Western blot检测FAK和ERK的蛋白水平

　　蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，并测定样本蛋白，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳、转膜和免疫显色。以封闭液分别稀释小鼠抗FAK单克隆抗体(1 ∶ 500)、兔抗p-FAK(Tyr397)多克隆抗体(1 ： 200)、兔抗ERK1多克隆抗体(1：500)或小鼠抗p-ERK单克隆抗体(1：200)，按每cm2膜加入0.1 mL一抗，封入袋内室稳轻摇，充分反应6 h。再次取出硝酸纤维素膜，TTBS振摇洗膜3次，每次10 min，以封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(1：3 000)或山羊抗兔IgG(1：5 000)。按每cm2膜加入0.1 mL二抗，封入袋内室温摇动孵育2 h。

　　1.7 统计学处理

　　数据均以均数 ± 标准差(x ± s)表示，利用SPSS 10.0软件进行统计分析。多组间均数差异性比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 K562细胞和CML急变期患者BMMNC表面整合素α5β1高表达

　　经FCM检测，健康志愿者BMMNC表面整合素α5(CD49e)和β1(CD29)表达阳性率分别为(64.0 ± 2.4)%和(72.4 ± 3.6)%。K562细胞和CML急变期患者的BMMNC表面整合素α5β1表达阳性率分别(97.6 ± 1.0)%、(99.2 ± 0.5)%和(91.2 ± 2.5)%、(93.4 ± 1.7)%。与健康志愿者BMMNC相比较，K562细胞和CML患者的BMMNC均存在整合素α5β1高表达，差异有显著性(P < 0.05)。用IFNα-2b预处理48 h后K562细胞整合素α5、β1表达阳性率未出现改变。

　　2.2 抗整合素α5β1抗体明显抑制K562细胞的增殖

　　MTT检测结果显示，Anti-α5β1和IFNα-2b均可抑制K562细胞的增殖。与IFNα-2b组相比，第1、2天IFNα-2b + Anti-α5β1各浓度组和单用Anti-α5β1各浓度组的K562细胞增殖抑制率明显升高并出现统计学差异(P < 0.01)。提示Anti-α5β1单独作用或与IFNα-2b联合作用较IFNα-2b单独作用时，对K562细胞的增殖抑制作用明显增强。第1、2天各组比较的F值分别为14.748、8.549，P值分别为0.000、0.007(表1)。

　　2.3 Anti-α5β1下调FAK mRNA和蛋白的表达

　　RT-PCR和Western blot结果显示，FAK mRNA及蛋白在健康志愿者BMMNC表达水平分别为(2.26 ± 0.42;2.54 ± 0.36)，K562细胞(1.04 ± 0.12;1.31 ± 0.15)和CML急变期患者BMMNC(0.99 ± 0.09;1.10 ± 0.13)，后两组细胞内FAK mRNA和蛋白的表达水平均显著低于健康志愿者BMMNC表达水平(P < 0.01)。用IFNα-2b处理K562细胞48 h后，FAK mRNA和蛋白表达水平(2.19 ± 0.12;1.93 ± 0.15)较未处理组K562细胞表达水平(1.04 ± 0.12;1.31 ± 0.15)明显上调(P < 0.01)，分别较未处理组增加111.3%和46.9%。与IFNα-2b组(2.19 ± 0.12;1.93 ± 0.15)比较，Anti-α5β1组(0.91 ± 0.12;1.34 ± 0.12)和IFNα-2b + Anti-α5β1组(0.10 ± 0.14;1.26 ± 0.16)的FAK mRNA和蛋白表达水平显著下降(P < 0.01);IFNα-2b + Anti-α5β1组和Anti-β1α5组与对照组(K562细胞组)比较无显著性差异(P > 0.05，图1)。FAK mRNA和蛋白各组比较的F值分别为7.831、8.041，P值分别为0.007、0.006。

　　2.4 Anti-α5β1降低FAK蛋白的磷酸化水平

　　与健康志愿者BMMNC的p-FAK蛋白表达水平(1.00 ± 0.13)相比，K562细胞(1.80 ± 0.11)和CML急变期患者(1.70 ± 0.11)BMMNC的p-FAK蛋白表达水平明显升高，有统计学意义(P < 0.01)。K562细胞经IFNα-2b和或Anti-α5β1孵育48 h后，p-FAK的蛋白水平较对照组均下降，但Anti-α5β1作用更显著(P < 0.05)。与对照组相比，IFNα-2b组(1.54 ± 0.13)、Anti-α5β1组(1.32 ± 0.13)和IFNα?鄄2b + Anti-α5β1组(1.24 ± 0.11)的p-FAK蛋白水平分别降低了13.9%、26.4%和30.8%。与IFNα-2b组相比较，Anti-α5β1组和IFNα-2b + Anti-α5β1组p-FAK的蛋白水平降低更明显(P < 0.05)，分别下降了17.96%和19.58%;F = 11.682， P = 0.000与Anti-β1α5组的p-FAK蛋白水平相比较，IFNα-2b + Anti-α5β1组的p-FAK蛋白水平也有所下降(2.2%)，但差异无显著性(P > 0.05，图2)。

　　2.5 Anti-α5β1可下调K562细胞ERK mRNA和蛋白表达

　　RT-PCR和Western blot结果显示，K562细胞和CML急变期患者BMMNC的ERK mRNA和蛋白表达水平分别为(2.56 ± 0.05和1.55 ± 0.13)及(2.57 ± 0.07和1.54 ± 0.10)，明显高于健康志愿者BMMNC(1.46 ± 0.07和1.05 ± 0.10，P < 0.01)。IFNα-2b和/或Anti-α5β1处理48 h后，K562细胞内ERK的mRNA和蛋白表达水平明显下降。与对照组比较，IFNα-2b组(2.41 ± 0.06和1.32 ± 0.11)、Anti-α5β1组(1.97 ± 0.13和1.14 ± 0.12)和IFNα-2b + Anti-α5β1组(1.89 ± 0.10和1.12 ± 0.10)ERK的mRNA和蛋白表达水平分别降低了5.9%和14.8%、23.0%和26.1%、26.2和27.8%(P < 0.05)。ERK mRNA和蛋白各组比较的F值分别为14.641、10.489，P值分别为0.000、0.002。与IFNα-2b组比较，Anti-α5β1组和IFNα-2b + Anti-α5β1组的ERK mRNA和蛋白表达水平均显著下降(P < 0.05，图1)。

　　2.6 Anti-α5β1可下调ERK蛋白的磷酸化水平

　　Western blot 分析结果显示，K562细胞和CML急变期患者BMMNC的p-ERK蛋白表达水平分别为(1.62 ± 0.09)和(1.57 ± 0.10)，明显高于健康志愿者BMMNC(1.03 ± 0.11，P < 0.01)。K562细胞经IFNα-2b和或Anti-α5β1孵育48 h后，p-ERK的蛋白水平较对照组均明显下降(P < 0.05)，其中IFNα-2b组(1.32 ± 0.11)、Anti-α5β1组(1.20 ± 0.12)和IFNα-2b + Anti-α5β1组(1.06 ± 0.11)分别降低了18.2%、25.6%和34.7%。与IFNα-2b组比较，Anti-α5β1组和IFNα-2b + Anti-α5β1组的p-ERK蛋白水平降低更明显(P < 0.05)，分别下降9.2%和20.2%(F = 9.177，P = 0.004)。较与Anti-β1α5组相比，IFNα-2b + Anti-α5β1组的p-ERK蛋白水平下降，但两者之间未出现显著性差异(图2)。

　　3 讨 论

　　研究表明，整合素α4β1和α5β1在CML祖细胞上高表达[1]，但由于整合素β1功能缺陷，不能发挥其介导细胞与基质间的粘附和抑制细胞增殖的功能，并通过激活细胞内异常信号传导通路促进细胞增殖。抗整合素α5β1单抗可能通过阻断整合素α5β1介导下游信号转导通路抑制细胞异常增殖的。

　　FAK和ERK是细胞内整合素信号通路中与细胞增殖有关的关键酶，在整合素介导的信息传递中处于核心地位[2，5，6]。FAK是细胞内多条信号转导通路的交汇点，是一种非受体型胞浆酪氨酸激酶，FAK自身磷酸化可使其激活，p-FAK(Try397)是FAK分子N-末端的磷酸化活化位点[3]。FAK活化后，可通过ras-MAPK(ERK)途径引起级联反应，最终影响细胞内相关的基因表达， 促进细胞增殖，对细胞的生物学行为具有重要影响[7]。本研究结果证实，Anti-α5β1和IFNα-2b处理后，K562细胞内p-FAK和p-ERK的蛋白水平较对照组显著下降，且前者作用更明显。有研究表明CML患者的骨髓单个核细胞中总FAK蛋白水平经IFNα-2b孵育48 h后较对照组明显升高，而p-FAK比例则显著降低，与我们的结论相似，因此我们推测，IFNα?鄄2b可能主要通过增加非磷酸化FAK蛋白表达水平，抑制FAK和ERK蛋白的磷酸化水平而正常传递整合素β1介导的细胞增殖抑制信号;在悬浮生长的细胞中，使用抗整合素抗体可使细胞表面整合素聚集成簇，提高FAK活性，抑制细胞增殖[8]。因此，抗整合素α5β1单抗可能主要通过阻断整合素α5β1介导的FAK-ras-MAPK(ERK) 异常增殖信号通路，降低FAK和ERK的磷酸化蛋白水平，恢复正常的增殖抑制信号的传递，而发挥抑制K562细胞增殖的作用。

　　信号转导的瀑布样级联效应最终要通过诱导或抑制核转录因子、调控基因转录，而影响细胞的生物学行为。研究表明，活化的ERK可通过直接影响转录因子c-fos和c-jun的基因表达，改变细胞行为，促进细胞增殖，并抑制其凋亡。ERK的激活可使c-Jun磷酸化、并形成c-Jun 同源二聚体或c-Jun/c-Fos异源二聚体，组成转录激活因子AP-1[9，10]，而影响细胞内某些基因的表达。事实上，影响K562细胞异常增殖的因素很复杂，可能涉及多种信号分子，抗整合素α5β1单抗是否在影响细胞的黏附和迁移中发挥作用，α5β1单抗引发的生长抑制是单独的FAK、ERK通路起作用，还是与影响细胞粘附和迁移相关，它们之间是否存在“串话”(cross talk)需要进一步深入研究。

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