刺五加多糖对人白血病K562细胞作用的研究

　　作者：罗强 孙 黎 刘 芳 薄爱华 作者单位：河北北方学院实验中心，河北 张家口 075000

　　【摘要】 目的:研究刺五加多糖对体外培养人白血病K562细胞有无增殖抑制和凋亡诱导作用。方法:取培养至对数生长期的K562细胞(密度为5×104/mL和1×106/mL)分别接种于96孔培养板(100μL/孔)及50mL培养瓶(1.5mL/瓶)中，加入不同浓度的刺五加多糖作用24h 后，用CCK8法检测刺五加多糖对K562细胞增殖抑制作用;荧光显微镜检测细胞凋亡。 结果:不同浓度刺五加多糖(0.405、0.810、1.620、2.430、3.240mg/mL)作用K562细胞24 h，抑制率分别为16%、27%、48%、50%、55%;荧光显微镜下观察发现培养K562细胞中出现核固缩、凋亡小体。结论:刺五加多糖对体外培养K562细胞生长有明显的抑制作用，可诱导K562细胞凋亡。

　　【关键词】 刺五加属 K562细胞 细胞凋亡

　　Study on Cell K562 Apoptosis Induced by Acanthopanax Senticosus in Vitro

　　LUO Qiang,SUN Li,LIU Fang,et al

　　Hebei North University，Zhangjiakou,075000,Hebei,China

　　【ABSTRACT】 Objective:To investigate whether the Acanthopanax Senticosus can inhibit proliferation of K562 cells and/or can induce apoptosis of human K562 in vitro.Methods:Cells(5×104/mL)were got at midexponential phase and then were planted in 96 well plates for 100μL each and in 50mL culture bottles for 1.5mL each.Cells were cultured for 48 hours with different concentration of Acanthopanax Senticosus.Growth inhibition rates were measured with CCK8 method.Apoptosis were detected through following ways:the changes of cell morphology were observed under fluorescence microscope with Hoechst33258 staining,agrose electrophrosis was used to detect the DNA changes and FCM was used to observe subdiploid.Results:Acanthopanax Senticosus can inhibit proliferation of K562 cells.K562 cells cultured with Acanthopanax Senticosus presented classical apoptotic morphology changes such as cell contraction (0.405、 0.81、 1.62、 2.43、 3.24mg/ mL)VS(16%、27%、48%、50%、55%),and apoptotic bodies under fluorescence microscope,and showed DNA fragmernt through agrose electrophrosis.In addition,the apoptosis were detected by flow cytometic analysis and showed apoptosis peak.The apoptosis rate was 5.53%.Conclusion:Acanthopanax Senticosus can inhibit proliferation and induce cell apoptosis in K562 in vitro.

　　【KEY WORDS】 Acanthopanax,K562 Cell,Apoptosis

　　刺五加在中医药学中的应用已有悠久的历史,近年来的研究证明刺五加和人参具有相似的药理作用和临床疗效,可增加机体的免疫和抗癌作用,且本身几乎无毒性,长期用药不会出现不良反应[1],刺五加主要抗肿瘤的药效部分是皂苷、多糖等[1,2],为探索分离其抗肿瘤活性部位的制剂工艺,并对其抗肿瘤活性部位的确定,曾开展过膜分离其不同药效部位,并就不同药效部位对S180肉瘤抗肿瘤和免疫调节的药效作用比较[3]。本实验根据这一特性，以人白血病细胞K562为研究对象,探讨刺五加多糖对K562细胞增殖抑制和凋亡作用，旨在为刺五加的开发应用提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料和议器 K562细胞购自河北医科大学，经河北北方学院实验中心细胞室传代冻存;RPMI1640培养基购自Gibcol公司;胎牛血清购自天津川页生物工程公司;细胞凋亡Hoechst染色试剂盒为江苏碧云天生物技术研究所产品;CCK8为上海同仁化学公司产品;庆大霉素为郑州羚锐制药有限公司产品;其他均为国产分析纯试剂。仪器选用荧光显微镜(BH2型OLympas,日本)及美国Stat Fax2100型酶标仪等。

　　1.2 刺五加多糖的制备 称取5.0g经清洗、烘干、去梗后粉碎的刺五加，置于250mL圆底烧瓶中，按正交表，加入相应的溶剂，充分振荡，浸泡1h后于恒温水箱中回流提取(每隔10min振荡一次)，过滤。再按同法二次提取，合并滤液，减压浓缩，定容至25.00mL,8磅15min高压灭菌4℃保存。

　　1.3 细胞培养 RPMI1640培养基中加入10%胎牛血清、庆大霉素100U/mL。用7.6%NaHCO2调至pH7.4，复苏K562细胞株，在RPMI1640培养液中,37℃、5%CO2饱和湿度下培养，至对数生长期。

　　1.4 CCK8比色法 取对数生长期的K562细胞(密度为5×104/mL)接种于96孔培养板上,100μL/孔。 刺五加多糖以RPMI1640培养液稀释成不同浓度(0.405、0.810、1.620、2.430、3.240mg/mL)加入96孔培养板，100μL/孔，每组设4个复孔。对照组加入等体积培养液，培养24h。实验终止前4h加入CCK8试剂20 μL/孔，继续培养4h后于酶标仪490nm波长处下测OD值，按下列公式计算生长抑制率:抑制率(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。

　　1.5 荧光显微镜观察 取对数生长期K562细胞(密度为1×106/mL)分别接种于6只50mL的培养瓶，1.5mL/瓶，实验组分别加入上述不同浓度的刺五加多糖1.5mL,对照组加入1.5mL培养液。培养24h后，1500×g离心7min，收集K562细胞，按照细胞凋亡Hoechst染色试剂盒说明操作，荧光显微镜下观察并拍照。

　　2008年10月罗 强等：刺五加多糖对人白血病K562细胞作用的研究第5期2008年10月河北北方学院学报(医学版)第5期

　　2 结果

　　2.1 刺五加多糖对K562细胞增殖的抑制作用

　　0.405、0.810、1.620、2.430、3.240mg/mL五种浓度刺五加多糖作用K562细胞24h后，对细胞的生长有不同程度的抑制作用，随着刺五加多糖浓度的增加，肿瘤细胞抑制率增加(P<0.05)，分别为16%、27%、48%、50%、55%，见表1。表1 不同浓度刺五加多糖对K562细胞增殖作用

　　2.2 K562细胞凋亡的形态学观察

　　荧光显微镜观察，对照组(图1A)，镜下可见细胞着色均匀，无凋亡细胞，说明对照组细胞的胞膜完整，未出现凋亡细胞。经刺五加多糖处理组(图1B、C、D、E、F，B0.405mg/mL、C0.810mg/mL、D1.620mg/mL、E2.430mg/mL、F3.240mg/mL，刺五加多糖浓度)有部分细胞出现亮色小体，说明刺五加多糖处理组的部分细胞发生了细胞核固缩、破裂，细胞膜出泡，有凋亡细胞出现。五个处理组所不同的是B、C出现的凋亡细胞数较少，D出现的凋亡细胞数稍多，E、F出现凋亡细胞数最多，表明随刺五加多糖的浓度升高凋亡细胞数也随之增加。

　　3 讨论

　　肿瘤的发生不仅与细胞的过度增殖有关,而且与细胞凋亡受抑制从而使已转化的细胞生存期延长有关[4]。研究表明许多药物的抗癌作用可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡而实现的,因此,诱导细胞凋亡尤其是利用植物提取物诱导细胞凋亡将成为肿瘤药物治疗的发展趋势。刺五加为五加科植物,具有益气健脾,抗高温、抗放射、抗肿瘤和增强机体抵抗力的功能。本研究通过CCK8比色法检测刺五加多糖对K562细胞的增殖抑制作用及Hoechst染色后荧光显微镜观察，发现经刺五加多糖诱导人白血病K562细胞后,肿瘤细胞体积缩小,染色质浓缩,细胞核呈新月形、环状或碎块状,并出现凋亡小体等典型凋亡形态学的改变，实验表明刺五加多糖能诱导人白血病K562细胞发生凋亡,且具有剂量和时间的依赖性。

　　刺五加多糖对肿瘤细胞的作用机理复杂，诱导肿瘤细胞凋亡并非其抗肿瘤作用的唯一途径。有关刺五加多糖及其与感染细胞凋亡关系的研究尚处于起始阶段，其作用机理有待于进一步研究。了解五加多糖与肿瘤细胞的凋亡及其相互作用的关系，探讨细胞凋亡发生机制，选择性地促进或抑制细胞凋亡的发生,将有助于为刺五加多糖治疗肿瘤提供新的依据。

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