兔脑缺血再灌注磁共振弥散成像与细胞凋亡相关性
发表时间：2010-05-21 浏览次数：390次
作者：刘珍友,隋庆兰，刘学军，金丽英，刘广义，郭云良 刘珍友(1971)，女，硕士研究生。 作者单位：(青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266003; 放射科;脑血管病研究所)
【摘要】 目的 分析兔脑急性缺血组织磁共振弥散成像(DWI)的影像学表现及其与细胞凋亡的关系，探讨DWI成像的病理基础。方法 58只新西兰大白兔随机分为永久缺血组(A组)和再灌注组(B组)，线栓法制作大脑中动脉缺血和缺血再灌注模型。其中A组分为缺血1、3、6、12、24与48 h(A1～A6)组;B组缺血1 h拔线再通后分为再灌注0、2、5、11、23和47 h(B1～B6)组。每组分别于各自时间点进行DWI成像，分别测量表观弥散系数(ADC)值并计算相对ADC(rADC)值。兔脑标本行细胞凋亡检测。结果 A组DWI高信号区逐渐增大，缺血24 h趋于稳定;ADC值呈先下降后上升的变化趋势。B组平均ADC值的变化呈双峰改变，缺血再灌注2 h的rADC值趋于正常化，DWI高信号区减小;5 h的rADC值最低，以后rADC值逐渐升高，DWI高信号区逐渐扩大。永久缺血组细胞凋亡逐渐增多，12 h达高峰，以后缓慢下降;再灌注组细胞凋亡数逐渐增多，幅度较永久缺血组低，高峰出现于再灌注23 h。 结论 细胞凋亡的发生与缺血的程度和持续时间有关，但细胞凋亡与ADC值的演变规律没有明显的相关性。
【关键词】 磁共振成像,弥散;脑缺血;细胞凋亡
MRIDWI AND APOPTOSIS AFTER ACUTE CEREBRAL ISCHEMIA AND REPERFUSION: AN EXPERIMENTAL STUDY IN RABBITS
LIU ZHENYOU, SUI QINGLAN, LIU XUEJUN, et al
(Department of Radiology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);
[ABSTRACT] Objective To analyze the relationship between cell apoptosis and Apparent Diffusion Coefficient (ADC) and explore the pathomechanism of DWI in rabbits undergoing reperfusion after acute cerebral ischemia. Methods Fiftyeight Newzeland white rabbits were divided into two groups in random: group A (permanentischemia group) and group B (reperfusion group). Models of middlecerebralartery ischemia (MCAI) and ischemiareperfusion (IR) were created. In which, group A was subdivided into subgroups of ischemia for 1, 3, 6, 12, 24, and 48 h groups,i.e.groups A1-A6; those in group B, recanalization after one hour of ischemia, and were reperfused for 0, 2, 5, 11, 23, and 47 h, i.e. groups B1-B6. Apoptosis of the rabbit brains were detected immediately after each time point of MRI examination. Results In group A, the hyperintensity area in MRIDWI increased gradually, and tended to stable at 24 h of ischemia; the rADC value decreased at first, and then increased. In group B, the rADC value increased at 2h point with shrinkage of hyperintensity area and decreased at 5h point. After that, the rADC value rose again with enlargement of DWI hyperintensity area. The number of apoptosis cells in group A increased and reached its peak at 12h time point and then lowered gradualy. In group B, the number of apoptosis increased gradually, reaching its peak at 23 h of reperfusion, but its extent was lower that that in group B. Conclusion The occurrence of apoptosis and the degree of ischemia are related to the duration, but apoptosis is not associated with the variation of DDC value.
[KEY WORDS] nuclear magnetic resonance, diffusion; cerebral ischemia; apoptosis
脑组织发生梗死后，在损伤区域内有高达50%的组织丢失是由细胞凋亡引起的[1]，因此,在缺血早期判断细胞凋亡能否发生及其程度，对临床准确选择合理的治疗方案，改善病人预后有重要意义。磁共振弥散加权成像(DWI)由于对缺血组织高度的敏感性成为近年来脑梗死早期诊断的首选影像学检查方法。早期的缺血性改变可以通过计算表观弥散系数(ADC)值及测量其体积来进行量化。本研究通过兔脑缺血及缺血1 h后再灌注，观察ADC值的演变规律并与细胞凋亡进行相关性分析，以期通过影像学手段预测细胞凋亡的发生程度。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物模型建立和分组
选择新西兰大白兔58只，由山东农业科学院实验动物中心提供，体质量为1.8～3.3 kg。随机分为永久缺血组(A组)30只和缺血1 h后再灌注组(B组)28只。应用线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注(MCAOR)模型。A组分为A1～A6组，即缺血1、3、6、12、24、48 h组，每组5只;B组再分为B1～B6组，即再灌注0 h组5只、2 h组 5只、5 h 组5只、11 h组 4只、23 h 组5只、47 h 组4只。另取10只作为假手术组，线栓插入后即拔出，不做其他处理，随机分为永久缺血对照(A0)组5只和缺血再灌注对照(B0)组5只。
1.2 扫描方法
采用GE Signa 1.5 T MR扫描仪，标准头线圈，在定位相上以视交叉平面为中心行冠状位连续扫描5层，层厚3.0 mm，层间距1.0 mm。DWI扫描参数：TR 7 000 ms，TE 84 ms，FOV 14 cm×14 cm，矩阵128×128，在X、Y、Z轴三个方向分别施加扩散敏感梯度(b值取0和1 000 s/mm2)。A组动物中，A2～A6各组除了于各自时间点行MR检查外，还均于缺血1 h时行MR检查;B组动物中除了B1组于拔线前、后均行即时MR检查外，其余均于拔线后行即时MR检查及各自时间点的MR检查。各组动物的DWI原始图像转到ADW 2.0工作站进行图像后处理，用Functool软件重建ADC图。测量ADC值并计算相对ADC(rADC)值，rADC=(病侧ADC/对侧ADC)× 100%。在DWI上显示病灶范围最大的层面测量高信号区的面积并计算该高信号区面积占同侧大脑半球面积的比率。
1.3 标本处理
每只动物于相应时间点行MRI检查后，立即开颅取脑，制成石蜡标本。自视交叉后方开始连续冠状切片，厚度7 μm，每隔10张抽取1张，置于预先用多聚赖氨酸处理过的载玻片上，4 ℃保存备用。
1.4 细胞凋亡检测
原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡的情况，试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。光镜下观察两侧大脑半球，分别计量各时间点双侧皮质、纹状体区的阳性细胞数，各取4个高倍视野(400倍)计数并取其平均值进行统计。
1.5 统计学处理
用Excel表格录入数据，所有数据以±s表示，采用SPSS 13.0及PPMS 1.5[2]统计学软件进行处理。不同时间点的rADC值、DWI上高信号区的面积及细胞凋亡数的比较采用单因素方差分析及q检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 A组DWI上高信号区范围和rADC值的变化
对照组10只动物行MR检查均未发现DWI上高信号及ADC值的异常。A组动物缺血1 h，DWI上均显示明显高信号并伴有ADC值和rADC值的下降。缺血后6 h，rADC值最低。DWI上高信号区的面积逐渐增大。各组间rADC值及DWI上高信号区的面积比较，差异均有显著意义(F=14.60、18.16，q=8.15～12.30，P<0.01)。见表1。表1 A组各缺血时间点高信号区平均ADC值和面积的比较(略)
2.2 B组DWI上高信号区范围和rADC值的变化
B1组分别于拔线前后行即时MRI检查，DWI上高信号区的范围于拔线前后比较无明显变化(P>0.05)。拔线后的平均ADC值近似于缺血1 h的水平，且拔线前后的ADC值差异均无显著意义(P>0.05)。再灌注2、5 h组表现为DWI上高信号区范围的减小，并伴随着ADC值先升高后降低，再灌注5 h时rADC值最低;11 h和23 h组表现为高信号区范围的增大，rADC值升高;47 h组表现为高信号范围增大，而平均ADC值再次轻度下降。各组间rADC值及DWI上高信号区的面积比较差异均有显著性(F=29.92、18.47，q=6.96～10.45，P<0.01)。见表2。表2 B组再灌注各时间点高信号区ADC值及范围的比较(略)
2.3 细胞凋亡的变化
2.3.1 A组细胞凋亡的变化
A组动物在缺血1 h时即出现凋亡细胞，缺血侧大脑半球皮质区出现的阳性细胞数明显多于纹状体区，随时间延长阳性细胞数逐渐增多，缺血12 h最多。各时间点阳性细胞数平均值比较差异均有显著性(F=8.78，q=17.61～24.16，P<0.01)。见表3。表3 A组各时间点凋亡细胞数(略)
2.3.2 B组细胞凋亡的变化
B组动物缺血1 h进行再灌注后，凋亡细胞数缓慢增加。但在各时间点凋亡细胞数均呈低于A组的趋势。B组各时间点阳性细胞数平均值比较，差异均有显著意义(F=12.51，q=9.85～14.66，P<0.01)。见表4。表4 B组各时间点凋亡细胞数(略)
2.4 相关分析结果
A、B组rADC值与凋亡阳性细胞数之间均无相关性(P>0.05)。
3 讨论
3.1 缺血区影像学表现
以前的研究结果显示，脑组织梗死区的平均ADC值和rADC值随时间的变化具有一定的演变规律，这种规律性的变化是由病变区的病理生理学变化引起的[3]。缺血发生后，神经细胞由于缺血低氧会引起细胞毒性水肿，导致ADC值下降。缺血晚期出现的平均ADC值上升与血管源性水肿有关。在组织学上，表现为神经元皱缩，细胞周围间隙扩大，星形细胞肿胀;最终神经元数量减少，部分神经元溶解消失，细胞突起变短或消失;白质内出现空泡，神经纤维束间隙增大等。
脑组织缺血后如果给予早期再灌注，可使已经降低的ADC值出现短暂性的升高，即“暂时性正常化现象”。产生这一现象的原因尚未完全阐明，但有一点已为很多研究所证明，即这种ADC值的正常化，与神经细胞形态学上的正常化之间没有相关性。FUHAI等[4]通过研究大鼠的脑缺血模型后指出，ADC值的暂时正常化与形态学异常的逆转没有相关性，并推测这种正常化的病理基础为细胞能量代谢的恢复。在再灌注晚期ADC值又会出现再次下降[57]，此时绝大多数神经元出现严重的皱缩，有一些出现胞浆嗜酸性变，星形细胞开始碎裂，二者已发生不可逆性损伤。这种损伤并不是迟发性低灌流所致，而是神经细胞原发损伤过程的继续[5]。本研究结果与上述结论基本相似。再灌注早期ADC值正常化期间，显微镜下缺血区仍然表现为神经元皱缩，星形细胞肿胀，细胞凋亡的数目较对侧增多;只是较A组神经元皱缩的程度较轻，细胞发生凋亡的数目较少。
3.2 细胞凋亡
有研究认为，缺血较轻时组织以凋亡为主，缺血较重时以坏死为主[8]。FERRER等[9]通过对成年大鼠缺血模型研究后认为，缺血中心区和边缘半影区具有不同的细胞死亡机制。其联合应用免疫组织化学法和免疫印记法测定半影区凋亡相关蛋白，发现半影区细胞浆和核内凋亡相关因子的表达增多，线粒体caspase依赖性途径激活，从而诱发细胞凋亡。MICHAE等[10]用生后7 d的大鼠行一侧颈内动脉结扎并低氧吸入2.5 h，随后进行MRIDWI检查和caspase3检测，发现在缺血24 h时，ADC值下降区内caspase3激活明显增加，而缺血刚刚发生时的ADC值不能预测5～24 h内的细胞毒性水肿和细胞凋亡。本研究结果虽然也显示ADC值与细胞凋亡在统计学上没有相关性，但我们仍然观察到在缺血6 h时ADC值最低，同期细胞凋亡数逐渐增多，缺血12 h时凋亡细胞数上升达到一个高峰值。缺血1 h进行再灌注后，尽管ADC值最低点发生于再灌注后5 h，但凋亡细胞数变化平稳，呈现缓慢上升趋势，不仅在各时间点阳性细胞的数量均明显低于A组，而且凋亡细胞数出现的高峰发生于再灌注23 h。以上现象提示细胞凋亡的数量与缺血的程度和持续时间有关;缺血早期再灌注会减轻缺血造成的损伤，延缓细胞的死亡。这一结果与文献报道的结果一致[1112]。但是否存在一个ADC阈值，当ADC值下降超过这一阈值时即会引起细胞凋亡的大量增加，这一问题尚需进一步研究。
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