恶性血液病自体造血干细胞移植后DCCIK细胞预防复发探讨

　　作者：王玲，史春雷，李颖，袁成录 作者单位：(青岛市中心医院血液科，山东 青岛 266042)

　　【摘要】 目的 探讨恶性血液病自体造血干细胞移植后应用树突状细胞细胞因子诱导的杀伤细胞(DCCIK)预防复发的效果。方法 12例恶性血液病病人自体造血干细胞移植后静脉输注及腹股沟注射DCCIK 细胞2～3次，观察疾病的复发情况以及DCCIK 细胞输注后的副作用。结果 7例持续完全缓解(CR)，中位CR期44(32～56)月。4例死亡，其中3例复发。结论 DCCIK细胞治疗可能有助于清除微小残留病，预防疾病复发，延长病人生存期，且副作用小，临床可以选用DCCIK细胞预防自体造血干细胞移植后恶性血液病的复发。

　　【关键词】 DCCIK细胞;造血干细胞移植;移植，自体;复发

　　EFFECTS OF DCCIK CELLS ON PREVENTION OF RECURRENCE OF MALIGNANT HEMATOPATHY AFTER HEMATOPOIETIC STEM CELL TRANSPLANTATION

　　WANG LING, SHI CHUNLEI, LI YING, et al

　　Department of Hematology, Qingdao Central Hospital, Qingdao 266042, China);

　　[ABSTRACT] Objective To observe the clinical efficacy of dendritic cells in combination with cytokineinduced killer cells (DCCIK) to prevent recurrence of malignant hematopathy after autohematopoietic stem cell transplantation (AutoHSCT).Methods After autoHSCT, 12 patients with malignant hematopathy were treated with DCCIK cells intravenously and intradermally for 2-3 times a week. The recurrence and side effects DCCIK were followed up. Results Complete remission (CR) was found in seven patients, the median CR period was 44 (range 32-56) months, four died, in which, recurrence was note in three patients. Conclusion Treatment with DCCIK cells may be helpful in clearing minimal residual disease, preventing relapse and prolonging the patients’ life with less side effects, which can be used to prevent recurrence of malignant hematopathy after autoHSCT.

　　[KEY WORDS] DCCIK cells; hematopoietic stem cell transplantation; transplantation, antologous; recurrence

　　自体造血干细胞移植是治疗恶性血液病的有效方法之一，自体造血干细胞移植可以将化疗剂量提高到致死量，从而达到减少残留病、降低复发率的作用。但是因为大剂量化疗后仍然存在微小残留病，不能完全解决移植后复发的问题，使得自体造血干细胞移植的应用受到一定限制。国内外采用体内外净化的方法去除移植物中部分残留的肿瘤细胞，但因为造价昂贵、植活时间延长等原因导致净化方法不能广泛应用。我院自2004年8月以来，对12例恶性血液病病人在自体造血干细胞移植后应用自体树突状细胞细胞因子诱导的杀伤细胞(DCCIK)治疗，观察其预防复发的效果以及副作用。现将结果报告如下。

　　1 资料和方法

　　1.1 一般资料

　　12例病人中，男8例，女4例，中位数年龄48(13～56)岁。其中急性白血病4例，分别为急性非淋巴细胞白血病(ALL)2例，急性淋巴细胞白血病2例;非霍奇金淋巴瘤6例;霍奇金淋巴瘤1例;多发性骨髓瘤1例。

　　1.2 DC和CIK细胞诱导方法

　　1.2.1 细胞诱导和采集

　　用IL2(山东泉港药业有限公司生产)100万单位+生理盐水静脉滴注，每天1次，连续诱导5 d。诱导结束后4 d，使用细胞分离单采机采集病人外周血单个核细胞。如果单个核细胞计数低于0.4×109/L，则用GMCSF 150 μg皮下注射，每天1次，连续注射1～3 d，然后再进行细胞采集。

　　1.2.2 细胞采集

　　使用细胞分离单采机(SPECTRA 6.0，COBE公司，美国)采集病人外周静脉血6～8 L，每120～150 mL血浆约采集(3～6)×109单个核细胞。

　　1.2.3 抗原制备方法

　　根据肿瘤类型选择相同病理类型的人肿瘤细胞株制备抗原，细胞株均购自中国科学院上海生物科学院细胞资源中心。将肿瘤细胞株培养至(1～2)×108个，收集细胞，生理盐水洗涤。将细胞置于RPMI 1640培养液中反复冻融，离心去残渣，上清液过滤备用。

　　1.2.4 DC和CIK细胞制备

　　采集的细胞按照常规方法分离并洗涤单个核细胞，调整细胞的密度至1×1010/L，平均加到16只细胞培养瓶(美国BD公司)中，于37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中孵育2 h，使贴壁细胞和悬浮细胞分离。取出悬浮细胞置另外细胞培养瓶中备用。在含有大量贴壁细胞的培养瓶中加入含有20 μg/L IL4、50 μg/L GMCSF的DC无血清培养基(德国CellGenix公司)，在37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中孵育，6 d后加入DC培养液和相应的肿瘤抗原继续培养2 d，即为成熟DC，部分回输，其余冻存。悬浮细胞的培养瓶中加入适量RPMI 1640培养液、灭活胎牛血清和IL2、 IFNα、CD3单抗(美国R&D公司)细胞因子等，在37 ℃体积分数0.05的CO2条件下培养。第8天细胞部分静脉回输，余细胞继续培养至15 d。

　　1.2.5 细胞表型检测和细胞计数

　　培养结束后，采用流式细胞仪检测DC标志DR和CD83，以CD3为标志来鉴定检测CIK细胞;回输前分别计数DC和CIK细胞。

　　1.3 治疗方法

　　自体造血干细胞移植造血恢复后1个月开始回输DC。回输前将DC均分，1份与CIK混合制成250 mL细胞悬液(内含1 500 U/mL 的IL2，体积分数0.01的清蛋白)，经静脉回输;1份制成1.5 mL细胞生理盐水悬液，皮下注射到肿瘤邻近的淋巴结区。上述治疗每周进行1次，共3次。疗程结束后1个月随访观察疗效。观察治疗前后血清干扰素γ(INFγ)、白介素10(IL10)和白介素12(IL12)含量变化等。

　　1.4 统计学方法

　　采用SPSS 10.0及PPMS 1.5[1]统计软件进行统计处理。

　　2 结 果

　　2.1 细胞表型检测和细胞计数

　　DC标志 DR和CD83的表达率分别为75%～84%和76%～85%，CIK CD3的表达率为88%～95%。每个疗程细胞总量：DC为(188.3±79.8)×106个，CIK为(58.8±22.3)×108个。

　　2.2 病人免疫指标观察

　　治疗前病人血清INFγ、IL10、IL12含量分别为(42.5±31.5)、(28.5±11.5)、(85.5±60.5)μg/L，治疗结束后1个月复查，病人上述指标分别为(65.0±45.0)、(30.1±18.1)、(89.1±71.1)μg/L，即治疗后血清中INFγ含量明显升高(t=3.679，P<0.05)，但IL10和IL12含量无显著改变(P>0.05)。

　　2.3 疗效及生存时间观察

　　12例恶性血液病病人中，7例持续完全缓解(CR)，中位CR期44(32～56)个月。4例死亡，其中3例复发，1例ALL，2例非霍奇金淋巴瘤，复发后因年龄较大或未找到合适的异基因移植而死亡。1例M4病人复发，经半相合异基因造血干细胞移植(供者为其子)后病情缓解，目前持续完全缓解24个月。

　　2.4 DCCIK细胞输注的副作用

　　12例病人共输注DCCIK细胞36次，有2例病人在输注DCCIK细胞后24 h内出现发热(最高体温38.5～39.5 ℃)、畏寒，应用消炎痛栓肛纳后2 h内体温恢复正常，无明显感染征象，无明显骨骼、关节疼痛，无明显白细胞、红细胞及血小板波动，无注射部位红肿热痛及静脉血管损伤。

　　3 讨 论

　　由于缺乏人类白细胞抗原(HLA)配型相合的供者，或者其他原因导致病人无条件进行异基因造血干细胞移植，自体造血干细胞移植支持下的大剂量化疗成为治疗恶性血液病的重要手段之一。临床研究发现，恶性血液病病人自体移植后约30%～40%出现病情复发[23]。因此，恶性血液病自体造血干细胞移植后如何预防肿瘤复发一直是近几年移植界所重点关注的问题之一。10年前大部分病人自体移植后进行半年左右的小剂量及中等剂量化疗，结果非但没能减少复发，反而增加了化疗后的感染率，化疗相关死亡率增加。原因可能是化疗药物通过作用于细胞分裂周期的不同环节，使细胞复制发生错误，而导致细胞死亡。因此，在理论上化疗只对处于繁殖期的细胞有杀伤作用，但对处于稳定期的肿瘤细胞疗效较差。5年前推崇的体内外造血干细胞净化疗法虽然理论上能够减少肿瘤细胞的污染，但因为能够导致移植后自体干细胞植活缓慢，增加了移植相关死亡，再者净化方法需要耗费巨大的财力，所以这种方法目前没有得到临床的广泛应用推广。近3年来，一些移植中心采用IL2静脉或皮下注射来预防复发，陈幸华等[4]应用大剂量化疗、自体造血干细胞移植、生物序贯疗法治疗非霍奇金淋巴瘤，结果移植前CR组复发率12.2%，部分缓解组复发率达到42.3%。提示自体移植后应用IL2可以降低CR病人的复发。我中心之前也曾经对4例白血病及淋巴瘤病人自体移植后注射IL2(28 d共3个疗程)，其中2例死于复发，2例CR存活至今。

　　细胞因子诱导的CIK 是一种高效、新型免疫活性细胞，CIK 用于治疗恶性肿瘤已经成为过继免疫治疗的重要手段之一。DC是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，它通过处理、呈递抗原而介导机体免疫应答。但是许多恶性肿瘤尤其是白血病、淋巴瘤等恶性血液病病人体内缺乏功能性DC，不能诱发抗原特异性T 细胞应答。自体移植时应用大剂量放化疗又加重了病人的免疫缺陷，使得免疫监控细胞功能丧失。所以，在体外诱导功能性DC 用于主动免疫治疗具有重要的临床应用价值。我们先分别培养DC与CIK，然后再将二者共同培养，使DC诱导CIK特异性应答，结果显示在共培养的过程中, CIK 中CD3+CD8+、CD3+CD56+的比例较单纯CIK 有不同程度的增高,说明大量成熟DC 进一步促进了CIK细胞的成熟，与国内外研究的结果一致。我们分析DCCIK抗恶性血液病的可能机制为：在体内受某些淋巴因子作用后，CIK细胞大量释放具有细胞毒性的胞浆颗粒到胞外，这些颗粒直接破坏瘤细胞，导致CIK细胞对肿瘤细胞的直接杀伤作用。我们的研究还显示，DCCIK细胞治疗后病人体内的INFγ水平明显升高，提示活化的DCCIK可以分泌多种细胞因子如INFγ、TNFα和IL2等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，而且还可以通过调节免疫系统间接杀伤白血病细胞。应用CIK细胞治疗后实体瘤病人CD3+细胞亚群比例显著升高，外周血中免疫活性细胞比例也明显升高，提示CIK细胞在体内外能明显抑制肿瘤生长，有效改善免疫功能。

　　自体DCCIK细胞是应用自体的外周血单个核细胞，在体外经细胞因子诱导产生的免疫杀伤细胞，静脉及皮下注射安全性好，无需进行抗排斥治疗，临床应用简便有效，病人的痛苦小。本研究中12例病人先后应用DCCIK细胞治疗36次，除了少见的发热外，未发现明显的血液学和非血液学毒副作用，证实了该疗法的安全性。

　　自体造血干细胞移植是在自体造血干细胞支持下，进行致死性的超大剂量化疗。目的是为了尽可能地杀灭体内的恶性肿瘤细胞，降低复发率，取得长期生存。在自体造血干细胞移植后应用DCCIK细胞，又能够通过免疫调节杀伤活力大大降低残留的甚至是髓性的肿瘤细胞。二者结合，在本实验中取得了较好的效果。我们还将继续扩大样本数量，改进二者序贯应用的方法和时机。总之，DCCIK细胞在自体造血干细胞移植后的应用可能有助于调节免疫功能，清除微小残留病，减少复发，进一步提高恶性血液病自体造血干细胞移植的疗效。而且该疗法安全、副作用小，值得临床推广试用。

　　【参考文献】

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　　[3]冯四洲,魏嘉璘,邹德惠,等. 自体造血干细胞移植治疗急性白血病病人143例疗效分析[J]. 内科急危重症杂志, 2005,11(3)：112115.

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