体外培养对家兔血管平滑肌细胞细胞周期和超微结构的影响
发表时间：2010-05-20 浏览次数：450次
作者：王生兰1 刘辉琦1 刘 杰1 王树人2△ 作者单位：(1.青海大学医学院病理生理教研室 ;2.四川大学基础医学与法医学院病理生理教研室)
【摘要】 目的 探讨体外传代培养对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)细胞周期和超微结构的影响，确认体外培养对VSMCs增殖和细胞表型的影响。方法 选择以未经培养传代的VSMCs和体外培养的第四代VSMCs作对比研究，采用流式细胞术检测VSMC细胞周期，透射电镜观察VSMCs的形态学特征,确定其表型转换及增殖特征。结果 电镜观察显示，未经培养传代的VSMCs胞浆中肌丝分布丰富、均匀，并可见到收缩表型VSMCs的典型结构——密斑，内质网、高尔基复合体等细胞器相对较少;而体外培养至第四代时VSMCs胞浆中肌丝明显减少，内质网、高尔基复合体明显增多。流式检测结果显示，体外培养至第四代时的VSMCs和原代细胞比较，细胞增值率增加;G0/G1期细胞减少，S期细胞增多。结论 VSMCs体外培养至第四代，在细胞增殖的同时，即可从典型的收缩表型转化为合成表型，提示VSMCs是一种很容易去分化的细胞，体外培养可使VSMCs增殖并伴表型转化。
【关键词】 血管平滑肌细胞 表型 体外培养 增殖 细胞周期
TRASTRUCTURE OF RABBIT’S VASCULAR
SMOOTH MUSCLE CELL IN VITRO
Wang Shenglan1, Liu Huiqi1， Liu Jie1，Wang Shuren2△，
(1.Pathophysiology Department of Qinghai University Medical College ;
2.Basic Medical Sciences and Forensic Medicine School of Sichuan University)
Abstract Objective To study the effect of subculture on cell cycle and ultrastructure of vascular smooth muscle cells(VSMCs)in vitro and affirm the effect of culture on proliferation and phenotype of vascular smooth muscle cell(VSMCs)in vitro. Methods Comparing primary VSMCs of rabbit with the fourth passages, cell cycle was detected by Flow Cytometry and morphology of VSMCs was detected by transmission electron microscope to confirm the phenotype transformation and proliferation characteristics. Results Electron microscope showed that the myofilament was abundant in cytoplasm of primary VSMCs and dense patch which is the typical structure of synthetic phenotype can be observed but endoplasmic reticulum and Golgi's complex was less, while VSMCs of fourth passage revealed less myofilament and abundant endoplasmic reticulum and Golgi's complex. Flow Cytometry showed cell proliferation rate increased, G0/G1 stage cells decreased and S stage cells increased gradually in the fourth passages compared with the primary VSMCs. Conclusion The results showed that the phenotype of VSMCs in fourth passages culture in vitro has been significant changed from contractile phenotype to the synthetic phenotype and VSMCs cells are easy to dedifferentiate. VSMCs proliferation will appear with phenotype transformation after culture in vitro.
Key Words VSMCs Phenotype Culture in vitro Proliferation Cell cycle
血管平滑肌细胞( vascular smooth muscle cells, VSMCS)的增殖是动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 、经皮冠状动脉介入治疗术后( percutaneous coronary intervention, PCI)再狭窄等血管疾病的主要病理特征 , VSMCs表型的转化是平滑肌细胞增殖和迁移的关键性起始步骤[1]。在 AS病变的发展过程中 ,VSMCs的迁移和增生是AS发展的重要事件 ,VSMCs作为粥样斑块中最主要的细胞成分 ,其增殖、向内膜下迁移、摄取脂质[2]成为肌源性泡沫细胞，是 AS的主要病理特征之一 。由于多种心血管疾病都涉及到VSMCs的增殖及表型转化，因此，确认VSMCs处于何种表型状态，对于许多涉及平滑肌异常增殖的心血管疾病的研究具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
新西兰大耳白兔由四川大学华西医学中心实验动物中心提供;Ⅰ型胶原酶(Collagenase Ⅰ)、胰蛋白酶(Trypsin)、DEME/F12干粉状培养基购自GIBCO.BKL公司;小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。
1.2 VSMCs的分离培养
新西兰大耳白兔(体重1.8～2.2kg)，处死后在无菌条件下分离胸腹主动脉，移入超净台，用刀背刮去内膜，从外膜上撕下中膜，用Ⅰ型胶原酶消化分离VSMCs。消化分离的细胞按1×105/mL细胞数接种于100 mL培养瓶中，用含20%小牛血清DMEM/F12培养基培养，传代培养至第四代使用。
1.3 流式细胞术检测细胞周期
1.3.1 原代细胞收集：将Ⅰ型胶原酶消化分离的VSMCs悬液，离心(1000r/min)5 min，弃上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入0.5 mLPBS混悬细胞。用4#注射针头将细胞打入4℃预冷的盛有乙醇的离心管中(乙醇终浓度为70%)固定，4℃冰箱保存。染色前用PBS洗涤，去除固定液。PI染色，4℃避光30 min后上机检测。
1.3.2 培养至第四代的细胞收集：培养细胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，离心，PBS洗涤，固定，染色，检测。
1.4 透射电镜观察VSMCs超微结构
取用Ⅰ型胶原酶消化分离的VSMCs，离心(1000r/min )5 min ，PBS洗涤细胞2次,加10 mL PBS吹打制成细胞悬液,移至离心管中,离心(1500～2000 r/min )15 min,弃上清液,用吸管沿管壁缓慢加入0.5%戊二醛,4℃环境下静置30 min,离心(12000r/min) 15 min,弃上清液, 用吸管沿管壁缓慢加入3%戊二醛固定液固定后, 进行常规透射电镜样本处理及透射电镜观察。
取培养于100 mL培养瓶中至第四代的VSMCs,用0.25%胰蛋白酶消化,在倒置显微镜下观察到细胞变圆,倒去胰酶,用血清终止消化, PBS洗涤细胞2次，预固定，固定，进行常规透射电镜样本处理及透射电镜观察。
2 结果
2.1 体外传代培养对细胞周期的影响
原代细胞细胞周期以G0/G1期细胞为主，S期细胞比例较低，体外传代培养至第四代时VSMCs细胞周期中各期细胞比例发生明显变化，G0/G1期细胞减少，S期细胞增多(见表1、图1)。表1体外培养对家兔VSMCs细胞周期的影响
2.2 体外培养对VSMCs超微结构的影响
透射电镜结果显示，未经培养传代的VSMCs胞核小、染色质致密，胞体中的主要组份为肌丝(图2-A)。体外传代培养至第四代时，VSMCs胞核大、染色质疏松，细胞中线粒体、粗面内质网、高尔基复合体明显增多，肌丝显著减少(图2-B)。
A B
A为原代VSMCs的超微结构(6000×)：核小而致密，胞浆中主要组份为肌丝，可见密斑(↑标记)，细胞器少，多位于核两端;B为体外传代培养至第四代VSMCs的超微结构(6000×)：核大而疏松，细胞中线粒体、内质网、高尔基复合体明显增多，肌丝显著减少.
图2 体外培养对VSMCs超微结构的影响
3 讨论
VSMCs是血管壁主要细胞成分之一，在成年个体是一种高度特化的细胞 ,具有收缩、调节血管张力和维持血压等功能，而不表现增殖能力，此时主要表达收缩蛋白[3]及收缩相关分子，为收缩表型。但当生长环境改变时可发生可逆的表型转换，去分化为合成表型。合成表型属于不成熟类型，分化程度低或未分化,形态上类似成纤维细胞,呈扁平形,肌丝含量少,结构蛋白少，合成和分泌基质蛋白能力强,主要功能是增殖、迁移入内膜形成病理改变和合成基质，细胞体积比收缩型为大。分化型VSMCs表型标志包括α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,SMA -α)、肌动蛋白相关蛋白(SM22-α)、平滑肌肌球蛋白重链( SM myosin heavy chain, SM - MHC )、重链钙调蛋白结合蛋白(h - caldesmon)、调宁蛋白( calponin)、平滑肌细胞分化特异性抗原( smoothelin )等;未分化VSMCs表型标志包括骨桥蛋白 (osteopontin,OPN )、epiregulin等[4]。AS 形成的关键是增殖的VSMCs [5]。许多细胞因子和血液中的某些成分可促VSMCs增殖, VSMCs在增殖过程中表型由收缩型向合成型转变,其表型转化和增殖所引发的血管重构是动脉粥样硬化和血管术后再狭窄等血管病变发生发展的根本原因[6]。
在血管平滑肌细胞的研究中，体外培养VSMCs是一种广泛采用的方法。但体外培养VSMCs必定涉及取材时的平滑肌细胞损伤及培养液中促生长因素的刺激，这必然带来VSMCs的表型转化及细胞增殖[7]。因此，确认待研的VSMCs处于何种表型状态，对VSMCs的研究具有重要意义。电镜下，典型的收缩表型和合成表型的VSMCs应具有明显的形态、结构区别：前者核小、染色质致密，胞浆富含收缩蛋白、肌丝，而较少内质网、高尔基复合体等合成、分泌性细胞器，而后者则核大、染色质疏松，少肌丝，但却富含合成、分泌性细胞器[8]。本研究显示,原代和体外传代培养至第四代的家兔VSMCs呈现典型的收缩和合成表型。原代VSMCs细胞周期滞留G0/G1期，体外传代培养至第四代后S期细胞逐渐增多,细胞增殖率增加。
家兔VSMCs体外培养至第四代，在细胞增殖的同时，即可从典型的收缩表型转化为合成表型，提示VSMCs是一种很容易去分化的细胞，体外培养可使VSMCs增殖并伴表型转化。多数体外VSMCs的研究取其2～5代传代细胞，因此，在结果解释时，应考虑表型转换对VSMCs形态、结构、基因表达谱的影响。
【参考文献】
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