慢性粒细胞白血病Ph染色体和bcrabl mRNA定量检测的临床意义

　　作者：吕晓东，范瑞华，胡杰英，徐本玲，张旭华，郭金东，宋云峰，宋永平 作者单位：(河南省肿瘤医院中心实验室，河南郑州 450008)

　　【摘要】 目的 探讨Ph染色体和bcrabl mRNA在慢性粒细胞白血病诊断、分期、治疗及微小残留病变监测中的意义。方法 同时检测437份慢粒标本的Ph染色体和bcrabl mRNA的表达情况。结果 慢性期、加速期和急变期的bcrabl mRNA定量结果逐渐增高(P<0.05);异基因造血干细胞移植后的bcrabl mRNA定量结果随时间逐渐降低，一般在移植6月后转阴，服用格列卫与异基因造血干细胞移植病程相似，但融合基因转阴所用时间较长。结论 实时定量PCR技术检测bcrabl mRNA较Ph染色体的检测更为敏感，对于疾病分期、评价疗效、监测微小残留病变以及预测疾病进展具有重要的临床应用价值。

　　【关键词】 慢性粒细胞白血病;实时定量PCR;Ph染色体;bcrabl

　　Clinical significance of detection of Ph chromosome and

　　Bcrabl mRNA in chronic myeloid leukemiaL Xiaodong, FAN Ruihua, HU Jieying, XU Benling, ZHANG Xuhua,

　　GUO Jindong, SONG Yunfeng, SONG Yongping

　　(Central Laboratory of Henan Tumor Hospital, Zhengzhou 450008, China)ABSTRACT: Objective To evaluate the significance of Ph chromosome and bcrabl mRNA expressions in diagnosis, staging and treatment of chronic myeloid leukemia (CML) as well as in monitoring minimal residual disease. Methods Expressions of Ph chromosome and bcrabl mRNA of 437 CML patients were detected at the same time. Results Expression of bcrabl mRNA gradually increased in blastic phase (BP), accelerated phase (AP) and chronic phase (CP) (P<0.05). Quantification of bcrabl mRNA decreased gradually after allotransplantation in the patients, and it became normal after 6 months treatment. However, quantification of bcrabl mRNA in imatinib mesylatetreated patients did not become normal until longer time later. Conclusion RTPCR quantitative detection of bcrabl mRNA is more sensitive than detection of Ph chromosome, and has an important clinical value in staging CML, monitoring treatment outcome, detecting the minimal residual disease and predicting disease development.

　　KEY WORDS: chronic myeloid leukemia; realtime quantitative PCR; Ph chromosome; bcrabl

　　慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种起源于造血干细胞的血液系统恶性疾病，细胞遗传学特征是具有Ph染色体，即t(9;22)(q34;q11)，其分子水平上形成bcrabl mRNA。染色体和融合基因的检测对CML的诊断、治疗及疗效评价有重要作用。我们对2006年12月～2009年8月门诊及住院437份慢粒患者标本的Ph染色体及bcrabl mRNA结果进行分析，明确融合基因定量检测在慢粒诊治及微小残留病变监测过程中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 2006年12月～2009年8月来自河南省肿瘤医院门诊及住院的291例CML患者的437份标本，同时进行Ph染色体和bcrabl mRNA定量检测，其中男175例，女116例，中位年龄36(9～82)岁。其中223例仅做了1次，68例分别作了2～9次检测，19例异基因造血干细胞移植患者共检测78份标本，24例服用格列卫患者共检测94份标本。根据患者的临床表现、血象、骨髓象、Ph染色体、bcrabl mRNA等结果参照文献[1]，确定慢性期CML 198例，加速期69例，急变期24例。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞遗传学分析 全部病例均采用骨髓细胞直接法或外周血不加植物凝集素的短期培养法(24h)制备染色体标本，然后采用热处理姬姆萨R显带技术进行核型分析。核型异常的描述参照《人类细胞遗传学国际命名体制(ISSN1995)》的有关规定。

　　1.2.2 bcrabl mRNA定量检测 RNA提取采取新鲜骨髓或血液标本经肝素或EDTA抗凝，用相对密度为1.077的淋巴细胞分层液分离单个核细胞。经TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA。

　　1.2.3 仪器与试剂 采用实时定量PCR方法检测bcrabl mRNA。仪器为ABI7300荧光检测仪。试剂来源于上海申友生物技术有限责任公司生产的白血病融合基因bcrabl检测试剂盒(核酸扩增荧光定量法)，严格按试剂盒说明书操作。

　　1.2.4 标本bcrabl水平的计算 根据标准曲线分别计算出各份标本abl和bcrabl的拷贝数。如果abl拷贝数≥3×103，即认为该标本可用。对于bcrabl拷贝数<5×102的样品均进行第2次扩增，bcrabl拷贝数取两次结果的平均值。

　　bcrabl水平(‰)=bcrabl拷贝数abl拷贝数׉

　　1.3 统计学分析 应用SPSS15.0统计软件进行统计学分析。慢粒各分期及治疗后不同时间数据的比较, 应用非参数检验的KraskalWallis H检验和秩和检验两两比较的t检验进行统计分析，检验水准α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 Ph染色体与bcrabl mRNA对比分析 437份标本同时检测Ph染色体与bcrabl mRNA，其中Ph染色体和bcrabl mRNA均阳性标本291份;Ph染色体阴性，bcrabl mRNA阳性[0.618(0.02～33)]标本39份，分别为异基因造血干细胞移植或服用格列卫后患者;Ph染色体阳性，bcrabl mRNA阴性标本15份，主要为标本采集不合格或可能表达P230bcrabl融合蛋白(本实验室未开展此项检测);Ph染色体和bcrabl mRNA均阴性标本92份，为异基因造血干细胞移植后或服用格列卫后分子遗传学完全缓解者。

　　2.2 不同分期CML患者 bcrabl mRNA定量结果分析 检测291例CML患者bcrabl mRNA水平，其中慢性期198例、加速期69例和急变期24例，定量检测结果分别为0.99‰、80‰和539.8‰，bcrabl mRNA水平逐渐增高，不同分期比较差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。表1 CML不同分期bcrabl定量结果

　　2.3 CML患者异基因造血干细胞移植后不同时间bcrabl mRNA分析 19例异基因造血干细胞移植患者，移植前与移植后不同时间bcrabl mRNA检测对比，其中3～6月bcrabl mRNA 55%转阴，较移植后3月内转阴高(39%)，且有统计学差异(P<0.05)。移植6月后，随访16名患者bcrabl mRNA定量结果全部转阴，与3～6月结果差异有统计学意义(P<0.05)。12月后随访6例患者，5例bcrabl mRNA仍为阴性，1例复发(3.8‰)(表2)。表2 异基因造血干细胞移植后不同时间bcrabl mRNA

　　2.4 CML患者服用格列卫后不同时间bcrabl mRNA分析 24例服用格列卫的CML患者，服药前与服药后不同时间bcrabl mRNA对比，其中服药后3月内和3～6月转阴分别为17%和23%，二者无统计学差异(P>0.05)。服药6～12月检测bcrabl mRNA 56%转阴，与3～6月内结果比较差异有统计学意义(P<0.05)。 12月后，随访的9例患者全部转阴，与6～12月内结果比较有统计学差异(P<0.05)(表3)。与异基因造血干细胞移植相比，服用格列卫患者bcrabl mRNA转阴较晚(图1)。表3 服用格列卫后不同时间bcrabl mRNA

　　3 讨 论

　　慢粒的Ph染色体和bcrabl mRNA检测已成为慢粒诊治及微小残留病变监测的重要手段，而PCR扩增技术可成百万倍地扩增放大目的基因，因此其灵敏度远高于Ph染色体，而且检测时间短、特异性强，弥补了染色体检查周期长、技术要求高、少数病例还会出现无分裂相或可供分析的分裂相有限等情况。本研究检测标本中，Ph染色体阴性，而bcrabl mRNA阳性标本有39份，这些患者分别为异基因造血干细胞移植或服用格列卫治疗后的患者，细胞遗传学已取得完全缓解，而分子遗传学上尚未转阴，提示利用RQPCR技术检测bcrabl mRNA更适用于微小残留病变的监测。

　　不同病期的CML骨髓增殖情况不同，白血病细胞的增殖也存在差异，慢性期和加速期的bcrabl mRNA水平均明显低于急变期，且均有统计学差异，与文献报道一致[2]。这为应用荧光定量技术检测bcrabl mRNA来诊断CML的白血病细胞的增殖情况和病程分期提供了理论依据。异基因造血干细胞移植利用移植物抗白血病反应清除肿瘤细胞，是慢粒根治的重要手段。而移植后短期内仍可检测到bcrabl mRNA，一般在移植后6个月左右消失[34]。本研究检测的19例患者中，移植后6月内仍有45%的患者未能转阴，而到6～12月时全部患者分子遗传学已完全缓解，与文献报道相似。其中有1例移植12月后随访，出现bcrabl mRNA阳性，而此时染色体尚未发现异常，提示复发，继续治疗。

　　格列卫针对bcrabl位点进行分子靶向治疗，PASCHKA等[5]研究发现，RQPCR结果显示患者经伊马替尼治疗达到细胞遗传学完全缓解时，绝大部分仍可检测到bcrabl mRNA，随着治疗时间延长，定量结果呈持续下降趋势，直至检测不到。本研究中24例服用格列卫的患者，随着服药时间的延长，bcrabl mRNA逐渐下降，12月后随访到的9名患者分子遗传学全部转阴，与文献报道一致。但无论采用何种治疗手段，bcrabl mRNA转阴后仍需继续监测，可早期提示疾病进展，为治疗带来机会。

　　【参考文献】

　　[1]张之南. 血液病诊断及治疗标准 [M]. 第2版. 北京：科学出版社, 1998:1931.

　　[2]ELMAAGACLI AH, BEELEN DW, OPALKA B, et al. The amount of BCRABL fusion transcripts detected by the realtime quantitative polymerase chain reaction method in patients with Philadelphia chromosome positive chronic myeloid leukemia correlates with the disease stage [J]. Ann Hematol, 2000, 79(8):424431.

　　[3]RADICH JP, GEHLY G, GOOLEY T, et al. Polymerase chain reaction detection of the BCRABL fusion transcript after allogeneic marrow transplantation for chronic myeloid leukemia: results and implication in 346 patients [J]. Blood, 1995, 85(9):26322638.

　　[4]CROSS NC, HUGHES TP, FENG L, et al. Minimal residual disease after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia in first chronic phase: correlations with acute graftversushost disease and relapse [J]. Br J Haematol, 1993, 84(1):6774.

　　[5]PASCHKA P, MULLER MC, MERX K, et al. Molecular monitoring of response to imatinib(Glivec) in CML patients pretreated with interferon alpha. Low levels of residual disease are associated with continuous remission [J]. Leukemia, 2003, 17(9):16871694.