抑癌基因PTEN在急性白血病发病中临床意义的探讨

　　作者：李静，殷献录，刘桂玲，姚伟，王景 作者单位：(安徽省蚌埠市第三人民医院 血液科，安徽 蚌埠 233000)

　　【摘要】 目的：研究抑癌基因PTEN在恶性血液病中的表达情况，探讨其与急性白血病(AL)的相关性。方法：选取恶性血液病74例[AL 35例，骨髓增生异常综合征(MDS)20例，慢性粒细胞白血病(CML)13例，骨髓增殖性疾病(MPD)6例]。另取非恶性血液病24例及正常骨髓10例作为对照。采用SP免疫组织化学检测骨髓单个核细胞中的PTEN表达情况，同时分析PTEN与临床指标的相关性，并对疾病转归进行跟踪随访。结果：PTEN阳性表达率在对照组中非恶性血液病患者(83.33%)低于正常人(90.0%),但差异无统计学意义(P>0.05),恶性血液病AL组(57.14%)与对照组差异有显著性(P<0.05);AL完全缓解(ALCR)组(63.16%)与对照组差异有显著性(0.05>P>0.01),AL初治组(55.17%)与ALCR组无显著差异(P>0.05),MDS组难治性贫血伴原始细胞增多(MDSRAEB)为53.33%,CML组为53.85%。MDSRAEB组和CML组与对照组相比均有显著性差异(均P<0.05)，但与AL初治组相比差异无显著性(P>0.05)。PTEN低表达与外周血中白细胞计数及发病时骨髓中原始细胞比例有一定相关性(r≈0.50),与MDSRAEB转化AL、慢性粒细胞白血病急性变(CMLAL)呈正相关性(r≈0.53)。结论：AL存在PTEN表达异常，PTEN与AL的发病可能有一定的关系,提示PTEN在AL的发病中有一定意义。

　　【关键词】 抑癌基因PTEN; PTEN蛋白; 急性白血病

　　Significance of tumor suppressor gene PTEN in the pathogenesis ofacute leukemia

　　LI Jing, YIN Xianlu, LIU Guiling, YAO Wei, WANG Jing(Department of Haematology, Third Peoples Hospital, Bengbu 233000， China)

　　[Abstract] Objective: To investigate the expression of tumor suppressor gene PTEN in hematologic malignancies and its clinical significance, as well as to explore its relativity with acute leukemia(AL) and role in pathogenesis and development of AL. Methods: The cases included 74 patients with hematologic malignancies: 35 patients with acute leukemia, 20 patients with myelodysplastic syndromes(MDS), 13 patients with chronic myeloid leukemia(CML), and 6 patients with myeloid proliferation disease(MPD). We took 24 patients with nonhematologic malignancies and 10 cases of normal human bone marrow as controls. The expression of PTEN in the bone marrow mononuclear cells was detected by SP immunocytochemical staining. We also did analysis on its relativity with clinical parameters and followup study on disease prognosis. Results: In control groups, the positive expression rate of PTEN in nonhematologic malignancies patients(83.33%) was lower than that in normal(90.0%), which was no significant difference(P>0.05). The positive rate in hematologic malignancy patients was 57.14%, which showed significant difference from controls(P<0.05). There were significant difference(0.05>P>0.01) between positive expression rate of PTEN in ALCR(63.16%) and in control groups, as well as between that in AL initial treatment(55.17%) and in ALCR. The positive rate was 53.33% in MDSRAEB and 53.85% in CML. Both showed significant difference from normal controls(P<0.05) but no significant difference from AL in initial treatment(P>0.05). PTEN low expression had certain relativity with peripheral blood leukocyte count and the proportion of progenitor cells bone marrow in pathogenesis(r≈0.50). CMLAL showed positive relativity with the transformation of MDSRAEB into MDSAL(r≈0.53). Conclusion: There is abnormal expression of tumor suppressor PTEN gene in Acute Leukemia, and PTEN may have some relativity with pathogenesis of AL, which suggests that PTEN has certain significance in the pathogenesis of AL.

　　[Key words] tumor suppressor gene PTEN; PTEN protein; acute leukemia

　　急性白血病(AL)是严重威胁人类生命健康的疾病。近年AL发病有上升的趋势，在我国恶性肿瘤死亡率中，AL在儿童及35岁以下成人居第1位。对AL病因、发病机制、早期诊断及预防治疗等研究已逐渐进入分子生物学水平。对肿瘤分子遗传学的研究中，不断有新的肿瘤相关基因被发现。作为继p53、pRb之后重要的抑癌基因PTEN(phosphatase and tensin hemolog deleted on chromosometen)已成为肿瘤学研究的热点[1]。PTEN与AL发生、发展的研究目前还处于起始阶段，AL与癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因等变化的相关性值得关注。为研究抑癌基因PTEN与AL的相关性以及探讨其临床意义，我们采用SP免疫组织化学检测方法，对白血病细胞中PTEN的表达水平进行了检测，旨在探讨PTEN表达情况与AL发生发展的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 病例选择

　　标本来源于2005年1月至2008年12月在我院血液科住院和门诊治疗的病例。恶性血液病74例中急性白血病(AL)35例：男16例，女19例，中位年龄47.5岁(6～73岁);急性髓细胞白血病(AML)23例[M2 2例、M3 7例、M4 5例、M5 9例]，急性淋巴细胞白血病(ALL)7例，急性混合细胞白血病(MAL)5例;初治29例，复发6例。骨髓增生异常综合征(MDS)20例：男11例，女9例，中位年龄53岁(23～75岁);难治性贫血伴原始细胞增多型(MDSRAEB)15例，难治性血细胞减少症伴多系发育异常(MDSRCMD)5例。骨髓增殖性疾病(MPD)19例：男11例，女8例，中位年龄51.5岁(34～86岁);慢性骨髓纤维化(CMP)2例，慢性粒细胞白血病(CML)13例，MPD不能分类4例。非恶性血液病24例：男11例，女13例，中位年龄49岁(14～77岁);再生障碍性贫血(CAA)16例，营养性巨幼红性贫血(MA)5例，难治性特发性血小板减少性紫癜(RITP)3例。所有病例均经临床、形态学、组化染色及免疫学确诊，急、慢性白血病均完善MICM诊断体系符合诊断标准[2]。

　　1.2 PTEN检测方法

　　(1) 试剂盒来源:①鼠抗人单克隆抗体PTEN(克隆号28h6)，购自北京中杉公司;②Eli Vision SP试剂盒[包括增强试剂(试剂A)、酶标单抗鼠/兔聚合物(试剂B)]、DAB显色剂，购自福州迈新公司。

　　(2) 采用骨髓活检标本石蜡切片检测。

　　(3) 阳性结果判断标准：①观察细胞核的颜色，蓝色为(-)、淡黄色为(+)、棕黄色为(++ )、黄褐色为(+++ )，根据染色的深度判断阳性表达的强度。②在400×显微镜下，随机数1 000个细胞(10个视野×100个细胞)，计阳性细胞的数目，阳性细胞的数目/1 000得阳性细胞百分数。

　　1.3 治疗方案

　　1.3.1 AL治疗方案 AML的DA方案：柔红霉素40 mg·(m3·d)-1，第1～3天静脉滴注;阿糖胞苷100 mg·(m3·d)-1，第1～7天静脉滴注。MA方案：米托蒽醌8 mg·(m3·d)-1，第1～3天静脉滴注。MEA方案：在MA方案中加用依托泊苷100 mg·(m3·d)-1，第1～5天。HA方案：高三尖杉酯碱3 mg·d-1，第1～3天静脉滴注。MA、MEA、HA方案中的阿糖胞苷(Ara.C)用法同DA方案。ALL的VDP方案：长春新碱2 mg·d-1第1、8、15、22天静脉注射，柔红霉素40 mg·(m3·d)-1第1～3天、第15～17天静脉滴注，泼尼松1 mg·kg-1·d-1第1～21天逐渐减量至28 d停用。VDLP方案：在VDP方案中加用L左旋门冬酰胺酶10 000 U第21～28天或第1～7天;部分初治及复发的病例第1～7天(或第1～10天)同时加用环孢菌素A 200 mg·d-1;慢性粒细胞白血病急粒变者按AL治疗方案治疗。

　　1.3.2 MDS治疗方案 小剂量Ara.C 25 mg·d-1分两次肌肉注射，疗程14～21 d。MDSRAEB：小剂量沙利度胺联合维甲酸，沙利度胺起始200 mg·d-1口服，无不良反应每两周递增100 mg，最大剂量500～600 mg·d-1，维甲酸30～40 mg·d-1口服。

　　1.4 疗效判定标准

　　对照张之南主编《血液病诊断与疗效标准》[2]。

　　1.5 统计学处理

　　检测结果和治疗效果的判断分别作对比分析、卡方检验(四格表资料χ2检验)。

　　2 结 果

　　2.1 骨髓细胞中PTEN表达

　　免疫组织化学染色显示：PTEN的阳性产物均为棕黄色或黄褐色。PTEN阳性表达率在对照组中非恶性血液病者(83.33%)低于正常人(90.0%),但差异无统计学意义(P>0.05)。AL组(57.14%)与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);AL初治组(55.17%)与对照组有显著差异(P<0.01)。AL完全缓解(ALCR)组(63.16%)与对照组差异有显著性(0.010.05)。MDS组MDSRAEB的为53.33%。MPD组CML的为53.85%。MDSRAEB及CML组与对照组均有显著差异(0.010.05)。各组PTEN表达情况见表1。表1 PTEN基因的表达情况注：AL中AML与ALL以及各亚型之间阳性表达情况因例数少而没有统计

　　2.2 PTEN表达与临床指标的相关性

　　PTEN表达情况与一些临床指标[外周血白细胞数(WBC)、骨髓白血病细胞比例]进行相关性分析，PTEN阳性表达率在WBC≥15×109 L-1组明显低于WBC<15×109 L-1组，差异有统计学意义(P<0.05)。骨髓白血病细胞比例≥60%组PTEN表达为25.93%(7/27)，明显低于骨髓白血病细胞比例<60%组的50.00%(4/8)，差异有显著统计学意义(P<0.01)。PTEN表达与临床指标的相关性见表2。表2 急性白血病PTEN的表达与临床指标的相关性

　　临床指标nPTEN表达阳性例数阴性例数外周血白细胞数(×109) ≥1520713 <151587骨髓白血病细胞比例 ≥60%27720 <60%844

　　PTEN低表达与发病时外周血白细胞计数以及骨髓中原始细胞的比例呈正相关(r≈0.50)2.3 PTEN表达与转归的相关性

　　经治疗MDSRAEB中PTEN阴性表达7/15(46.67%)，转化为MDSAL 6/7(85.71%);CML阴性表达6/13(46.15%)，转化为CMLAL4/6(66.67%)。PTEN基因的表达与MDSRAEB转化MDSAL、CML转化CMLAL呈正相关(r≈0.53)。

　　3 讨 论

　　抑癌基因PTEN是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，在多种肿瘤的发生发展中均被发现与PTEN的突变与失活相关。作为继p53、pRb之后重要的抑癌基因，PTEN的研究已成为目前研究的热点[3]。已有研究显示，PTEN基因的异常是通过其蛋白酪氨酸酶的活性，阻断促肿瘤因子介导的细胞信号传导通路，从而抑制细胞生长、转化、迁移，促进细胞的凋亡，对肿瘤的生长、侵袭、转移起负调控作用。当PTEN水平降低时，机体的抗癌能力下降，细胞易发生恶变，发生肿瘤[4]。近来研究发现,PTEN蛋白对造血干细胞的活化、分化起重要的调控作用,并阻止白血病的发生[5]。

　　目前有研究证明，PTEN在白血病中可能有以下几种作用方式：(1) 间接失活机制，如引导PTEN转录的因子异常和转录后修饰的改变。(2) 通过负调控PI3K/AKT途径发挥抑癌基因功能，同时影响肿瘤细胞对药物的敏感性。(3) 通过免疫调节发挥抑癌基因的功能，且主要是通过负调控PI3K/AKT途径发挥抑癌基因的功能[6]。随着对PTEN的深入研究，已有学者发现证实PTEN还可能通过多种机制失活,除碱基突变、缺失、启动子区域甲基化等在基因水平上的异常外,在翻译过程中或者蛋白水平上还受其他因素调控[7]。

　　沈权等[8]报道,87例初诊AL患者的阳性率仅为18.29%，PTEN在细胞K562中有表达，在AL及ALCR中的表达均低于正常水平。邹兴玉等[9]研究发现，PTEN基因在MDS及AML中转录的缺失率并不高，但转录的水平明显降低，在蛋白水平其表达缺失率明显高于正常者，且与mRNA表达水平不一致。这些都证实PTEN基因的表达异常参与了AL的发生和疾病的进展。

　　本研究结果表示，初治AL、高危MDS(MDSRAEB)PTEN的表达阳性率低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，与目前国内相关报道相一致。提示AL及高危MDS存在PTEN的表达异常，可能PTEN的表达缺失或低表达与AL的发病有相关性。MPD及除MDSRAEB外的MDS者PTEN阳性表达低于正常对照。提示可能PTEN表达缺失或低表达在MPD及除MDSRAEB外的MDS亚型中并不常见;或者是否存在着表达的量的异常;或者是受到病例数少、检测水平及实验的敏感性的影响等还有待探讨。PTEN是否可以作为影响疗效(或判断是否有效)的“独立因素”，尚不能肯定。分析PTEN与临床指标的相关性发现，PTEN低表达与患者发病时外周血中白细胞数及骨髓中原始细胞比例呈正相关性(r≈0.50)，与其它具有预后意义的染色体异常之间无相关性，与之前相关报道比较一致。提示PTEN在白血病中的表达异常，可能与白血病细胞浸润有相关性。

　　本次实验对MDSRAEB及CML疾病转归随访发现，PTEN基因的低表达与MDSRAEB转化AL、CML转化CMLAL呈正相关(r≈0.53)。提示PTEN表达率明显低者，存在向AL转化的风险，PTEN表达异常与疾病的恶性程度相关。PTEN是否可以作为一个独立的影响因素用于判断病情、估计预后，有待进一步证实。

　　PTEN与血液病的研究虽然尚有许多未知的领域，但PTEN将会成为早期诊断、评估病情、预测预后以及基因水平治疗的重要分子水平的依据，亦会为新的抗肿瘤药物的研发及指导临床治疗提供新的思路。

　　【参考文献】

　　[1] 孙晓东，柴忆欢，曹幼甫，等.骨髓组织PTENmRNA和hTERT DNApKCS检测对急性白血病的临床意义[J].中国血液流变学杂志,2006,6(4)：558560.

　　[2] 张之南,沈悌.血液病诊断与疗效标准[M]. 2版. 北京:科学出版社,1998:214218.

　　[3] 邹向阳,张秀蓉,姜涛.抑癌基因PTEN与肿瘤[J].大连医科大学学报,2006,28(1):6770.

　　[4] MOON S K， KIM H M， KIN C H. PTEN induces G1 cell cycle arrest and inhtbits MMP9 expression via the regugltion of NFkappaB and AP1 in vascular smooth muscle cells[J].Arch Biochem Biophsy,2004,421(2):267276.

　　[5] ZHANG J, GRINDLEY J C, YIN T, et al. PTEN maintains haematopoietic stem cells and acts in lineage choice and leukaemia prevention[J]. Nature,2006,441:518522.

　　[6] UDDIN S, HUSSAIN A, ALHUSSEIN K,et al. Inhibition of phosphatiealy linositol 3′kinase induces preferentially killing of PTENnull T lenkemias through AKT pathway[J]. Biochem Biophsys Res Commun,2004,320(3):932938.

　　[7] VASUDEVAN K M, GURUMURTHY S, RANGNEKAR V M. Suppression of PTEN expression by NFkappa B prevents apoptosis[J]. Mol Cell Biol,2004,24:10071021.

　　[8] 沈权,陈泽,刘旭萍,等.抑癌基因PTENmRNA在白血病细胞中的表达及意义[J].中华血液病学杂志,2005,26(8):493495.

　　[9] 邹兴立,刘霆,孟文彤.抑癌基因PTEN在骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的表达[J]. 中国实用血液学杂志, 2008,16(5):10861090.