大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1片段结合功能的体外研究

　　作者：张迎红，胡 豫*，梅 恒，王华芳，郭 涛，魏文宁，方 峻， 孙春艳，王雅丹 作者单位：华中科技大学同济医学院血液病研究所,湖北省生物靶向实验室, 武汉 430022

　　【摘要】 目的 探讨大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1片段与脂多糖( LPS)刺激后的大鼠血管内皮细胞(RAOEC) 结合能力。方法 将0.1 mg/L LPS作用RAOEC 2 h、4 h、6 h、18 h,应用免疫荧光法检测TF蛋白在RAOEC的表达,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L的大鼠凝血因子ⅦE GF 1多肽与LPS作用后的RAOEC的结合能力。结果 0.1 mg/L LPS能刺激RAOEC表达组织因子(TF),4 h最为明显，4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1能结合 LPS刺激后的RAOEC。结论 大鼠凝血因子ⅦEGF1片段能结合 LPS刺激后RAOEC 。

　　【关键词】 凝血因子Ⅶ; RAOEC; LPS

　　合物能增加FⅦa对其底物Ⅸ和Ⅹ的蛋白水解活性，所以能激活内、外源性凝血途径，TF/FⅦa复合物被认为是引发凝血瀑布的关键蛋白[1]。血栓形成的机制极为复杂,涉及血管壁、血小板、凝血及纤维溶解系统,而凝血活性异常是动脉血栓形成的主要原因之一。本实验研究大鼠凝血因子Ⅶ EGF1片段与LPS刺激后表达TF的内皮细胞结合,为进一步研究TF的调控及血栓形成的防治打下基础。1 材料与方法

　　1.1 材料 RAOEC及培养液购自美国Cellapplication 公司。FITC标记的大鼠凝血因子Ⅶ EGF1多肽由西安华辰生物科技有限公司合成。LPS购自Sigma公司。 TF多克隆抗体和FITC二抗试剂盒购自武汉博士德公司。免疫组化SP试剂盒均为即用型，购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养与分组 细胞置于37 ℃,5 % CO2 孵箱培养,每2 天换液1 次,细胞呈铺路石状,3~4 d细胞生长汇合后,用0. 25 %胰酶∶0.2%EDTA=1∶1混合消化传代。用4~6代细胞进行实验。将培养的RAOEC分为2组：① 阴性对照组：不加LPS刺激。② LPS诱导组:0.1 μg/ml LPS刺激RAOEC 2 h、4 h、6 h、18 h。

　　1.2.2 TF抗原的检测 将生长良好的RAOEC以2×105 /孔分别接种于预先置有盖玻片的24孔板中爬片，常规培养24 h贴壁后，加入0.1 μg/ml LPS，于37 ℃,5 % CO2 条件下作用0、2、4、6、18 h，终止培养做免疫组化分析。采用免疫组化SP法, DAB显色,以PBS代替一抗作为阴性对照, 以已知的阳性(表达TF抗原的)小鼠黑色素瘤细胞B16F10作为阳性对照,免疫组化步骤按SP试剂盒说明书进行。免疫组化结果判断: TF阳性定位于细胞浆或细胞膜。计数200个细胞，计算阳性细胞率。

　　1.2.3 流式细胞仪检测FⅦ EGF 1多肽结合活性 将生长良好的RAOEC以1×106/孔分别接种6孔板，24 h待细胞贴壁后诱导组每孔加入0.1μg/ml LPS作用4 h，对照组不加LPS处理，PBS洗涤后两组加入4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L大鼠凝血因子ⅦEGF 1多肽，空白对照组不做任何处理，37 ℃,5 % CO2 条件下孵育2 h，用0. 25%胰酶∶0.2%EDTA=1∶1消化，PBS充分洗涤3次后上流式细胞仪检测。

　　1.2.4 荧光显微镜观察FⅦ EGF 1多肽结合活性 将生长良好的RAOEC以2×105 /孔分别接种于预先置有盖玻片的24孔板中爬片，常规培养24 h贴壁后， LPS诱导组细胞中分别加入0.1 μg/ml LPS作用4 h，PBS洗涤后与阴性对照组分别加入8 μmol/L大鼠凝血因子ⅦEGF 1多肽，37℃孵育2 h，PBS充分洗涤后在倒置荧光显微镜下观察。

　　1.3 统计学分析 以上试验重复3次，应用SPSS 12.0 统计软件包进行统计分析,采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 LPS刺激RAOEC后TF抗原表达的结果 LPS诱导组与阴性对照组(16.22%±1.34%)比较,TF表达水平明显增高(见图1，图2),以作用后4 h最为明显(42.67%±3.02%),二者差异具有显著性(P<0.01) 。LPS作用于RAOEC 2 h后TF即有表达增加(29.79%),至4 h达高峰(43%),6 h TF表达量开始下降(32.89%),至18 h下降到接近未刺激前水平(18.34%)。

　　2.2 流式细胞仪检测FⅦ EGF 1多肽结合活性 与阴性对照组相比，大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1多肽能结合LPS刺激后RAOEC，差异具有显著性意义(P<0.01)，随着多肽浓度的增加，荧光细胞增多，但16 μmol/L EGF 1多肽作用LPS刺激后的RAOEC，荧光细胞百分率降低。见表1。表1 流式细胞仪检测大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1片段结合功能 荧光细胞(%)空白对照组 0.95±0.34阴性对照组+4μmol/L EGF 1多肽 18.56±1.25LPS诱导组+4μmol/L EGF 1多肽 42.26±2.56*LPS诱导组+8μmol/L EGF 1多肽 86.78±2.49LPS诱导组+16μmol/L EGF 1多肽 49.54±3.73 与阴性对照组相比,*P<0.01

　　2.3 荧光显微镜观察FⅦ EGF 1多肽结合活性 与阴性对照组相比，大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1多肽能明显结合LPS刺激后RAOEC(见图3，图4)。

　　3 讨 论

　　在体内正常的内皮细胞不表达TF ,培养的内皮细胞不表达或低表达TF【2】，培养的细胞在一系列因素刺激下可以高表达TF，包括细菌脂多糖LPS【3】，某些炎症细胞因子如白介素1、肿瘤坏死因子、氧化的低密度脂蛋白、凝血酶和佛波醇等，这些说明TF在各种病理进程中起着重要的作用【4】。本试验用0.1μg/ml LPS作用RAOEC 2、4、6、18 h，观察细胞TF 的表达, 结果发现LPS作用于RAOEC 2 h后TF 即有表达,至4 h达高峰。 6 h有所下降，18 h下降到接近未刺激水平。大量研究证明，人凝血因子FⅦGla区、EGF1区和重链的第195～206的残基以及其它某些部位可能参与FⅦa与TF之间的相互作用[5]。最早研究的是FⅦa的Gla区，研究者利用组织蛋白酶G的酶解作用和缺Ca2+条件下FⅦa的自分解作用分别产生脱去残基1～38和1～44的FⅦa，FⅦa与TF的亲和性明显降低，说明FⅦa的Gla区对FⅦa与TF结合具有重要影响。但纯化的FⅦa Gla区(即只含有FⅦ 的1～38位残基的结构)不能抑制FⅦa与TF的结合，这说明Gla区本身并不含有形成稳定的FⅦaTF复合物所必需的结构成分。Petersen等[5]的研究结果进一步阐明，Gla区作用在于诱导FⅦa分子Ca2+依赖性结构变化，而表达一个或者多个直接涉及与TF结合的部位。EGF区也是涉及与TF结合的结构。研究证明， 与EGF1区产生特异性反应的单抗直接抑制FⅦa与TF的结合。采用以FⅦa轻链与FⅦ 重链构成的嵌合体与TF脱辅基蛋白的结合来检验FⅦa与TF结合的区域，结果发现FⅦa轻链的EGF区具有与TF结合的高度亲和性[6]。目前关于大鼠凝血因子FⅦ与TF结合部位尚无报道。Shobha等[7]克隆并表达了大鼠凝血因子FⅦ，并将人的凝血因子FⅦ与大鼠的核苷酸序列进行了比较，发现如人与大鼠约有68%序列完全一致，78%类似，其中EGF 1区有75%序列完全一致，而重链的第195～206位的核苷酸序列只有50%序列完全一致，所以本试验选择大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1区，探讨其与TF的结合能力。本试验发现大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1多肽与LPS刺激后RAOEC结合，与阴性对照组相比，差异具有显著性意义。随着肽浓度的增加，荧光细胞增多，16 μmol/L大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1多肽结合细胞减少可能是由于肽的浓度过高对细胞的毒性作用所致。近年来研究已证实TF不仅参与凝血反应，而且在肿瘤血管内皮细胞和许多恶性肿瘤(尤其是腺癌)如黑色素瘤、肺癌、前列腺癌和乳腺癌细胞等，以及肿瘤间质细胞表面存在过度表达，导致肿瘤患者血液凝固性增高，并具有促进肿瘤生长、浸润、转移的作用，与肿瘤血管生成密切相关[8]。值得注意的是，TF介导的肿瘤生长、浸润、转移均必须有 FⅦa的参与，而与 FⅦa-TF复合物诱导的凝血酶生成无关[9]。因此，众多研究者试图利用FⅦ阻断TF，从而控制血栓前状态和攻克肿瘤。Gary [10]曾通过(P10Q/Q32E)点突变增强FⅦa的结合TF的能力，但不启动凝血的发生，但由于此片段过长不利于基因的干预，另外在体内的稳定性差等缺点将会限制其用途，所以大鼠凝血因子Ⅶ EGF 1多肽结合功能的初步研究的成功将为后续的血栓疾病和肿瘤疾病的治疗带来契机。

　　【参考文献】

　　[1] DAVIE EW, FUJIKAWA K, KISIEL W. The coagulation cascade: initiation,maintenance and regulation[J]. Biochemistry, 1991,30:10363 10370.

　　[2] FEI H,BERLINER JA,PARHAMI F，et al. Regulation of endothelial cell tissue factor expression by minimally oxidized LDL and lipopolysaccharide[J].Thromb，Vasc，Biol，1993，13：17111717.

　　[3] DRAKE TA, PANG M. Effects of interleukin1, lipopolysaccharide and streptococci on procoagulant activity of cultured humol/Lan cardiac valve endothelial and stromal cells[J]. Infect Immun， 1989，57: 507512.

　　[4] MACKMAN N, SAWDEY MS, KEETON MR, et al. Murine tissue factor gene expression in vivo: tissue and cell specificity and regulation by lipopolysaccharide[J]. Am J Pathol,1993,143:7684.

　　[5] PETER WI, LATIF KA, WALTER KI.The importance of residues 195206 of humol/Lan blood clotting factor VII in the interaction of factor VII with tissue factor [J].Biochemistry, 1990, 9(87): 72907294.

　　[6] TOOMEY JR，SMITH KJ，STAFFORD DW，et al.Localization of the humol/Lan tissue factor recognition determinant of humol/Lan factor VIIa[J].J Biol Chem,1991,266(29)：19198-19202.

　　[7] SHOBHA Seetharam*, MURPHY K, ATKINS C,et al. Cloning and expression of rat coagulation factor VII[J] .Thrombosis Research ,2003 ,109:225 231.

　　[8] FERNANDEZ PM， PATIERNO SR，RICKLES FR.Tissue factor and fibrin in tumol/Lor angiogenesis[J].Semin Thromb Hemost,2004 ,30(1)：31-44.

　　[9] OLLIVIER V， BENTOLILA S，CHABBAL J，et al.Tissue factordependent vascular endothelial growth factor production by humol/Lan fibroblasts in response to activated factor VII[J].Blood,1998,91(8)：26982703.

　　[10] GARY L. NELSESTUEN，STONE M ,et al. Elevated Function of Blood Clotting Factor VIIa Mutants That HaveEnhanced Affinity for Membranes[J] .The Journal of Biological Chemistry, 2001,276( 43): 39825 39831.