检测体系间凝血参数标准化的可行性探讨

作者：李健，丛玉隆，王成彬，谭笑红，陈 伟，邸 平    作者单位：1.中国人民解放军总医院，北京，2.沈阳军区210医院，沈阳     【摘要】  目的 使用冻干定值血浆进行校正以减少检测体系之间凝血酶原时间（PT）换算的国际标准化比值（INR）的差异。方法 将STAR、ACL Advance和CA7000等3种全自动凝血仪分别与非配套试剂组合应用，测定不同INR水平的标本的PT和INR，利用PTmulti calibrator特殊定值血浆建立体系特异的PTINR校正曲线,重新计算这两个参数，与配套试剂的检测结果比较分析。结果 不同仪器使用同一试剂测定结果虽然相关性良好，但是彼此差异具有统计学意义（P<0.001）。体系校准不仅在全部使用配套试剂时可以减小检测体系间的差异，使用替代试剂时，在一定程度上也能够减小与原体系的差异。结论 体系校准的方法有助于减少检测体系之间由于仪器或试剂的不同而产生的差异，提高凝血活性检验的标准化程度，更好地保证相关参数的可靠性。

    【关键词】  凝血酶原时间； 国际标准化比值； 定标

    Enhancing the Standardization of International Normalized Ratio with Lyophilized

    Plasma Calibrants

    LI Jian1，CONG Yulong1，WANG Chengbin1，TAN Xiaohong2，Chen Wei1，DI Ping1.

    （1. Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853， 2.The 210 Hospital of Shenyang Command. Shenyang 116021, China）

    Abstract： Objective  To reduce the variability of international normalized ratio(INR) reporting prothrombin time(PT) amoung laboratories or detecting systems, evaluate the applicability of lyophilized PTmulti calibrator in multisystem calibrations. Methods  Eastablishing a local ISI and PTINR calibration curve for reagent and equipmentspecial system with PTmulti calibrator, respectively. Samples were collected and divided into 3 groups corresponding to their INRs, determined by diffirent conbinations of certain equipment and reagent recommanded by manufacture or subsititude reagent. Results  The linear correlation between any two systems with similar method was good enough, but the mean values still have statistical difference. With the help of PTINR curve, gaps between systems were minimized (P>0.05), especially when “substitute” reagent is used. Conclusion  Calibration with special calibrator is necessary to improve the INR accuracy and interlaboratory precision, when reagents not assigned by the manufacture are used or analyzing system has any change.

    Key words：  Prothrombin time； International normalized ratio； Calibration

    凝血检验是包括仪器、试剂和环境组成的完整体系，任一因素的变化都会影响测定结果。凝血活酶试剂来源不同可导致凝血酶原时间（PT）检测结果的差异。为了修正这种由试剂产生的结果差异，国际标准化比值（INR）应运而生。目前国内广泛使用着多种检测方法不同的仪器，即便使用的凝血活酶试剂标定了国际敏感度指数（ISI），也会因为检测终点的不同而影响结果；另一方面，很多用户使用替代试剂以降低成本，往往替代试剂标示的ISI是单一的，并不适用于所有机型，或者该ISI不具备符合要求的溯源性，导致INR有形无实。尽管用户在应用新设备或替代试剂之前会建立定标曲线，新检测体系与原体系也仅仅停留在数学相关水平上，数据不可能是一致的。此外，受试人群的地区差异也使建立实验室专门的ISI显得尤为必要[1，2]。我们应用Dade Berhing公司的PTmulti calibrator冻干血浆在不同凝血分析体系上进行了校正和分析。

    1  材料和设备

    Dade Berhing公司生产的PTmulti calibrator系统定标血浆。全自动凝血分析仪分别为STAR（Diagnostic Stago, 法国）、ACL Advance（Instrumental Laboratory，荷兰）和CA7000（Sysmax, 日本）。原厂配套试剂分别为Neoplastin CI plus（Diagnostic Stago, 法国, 060772, ISI:1.27）、PTFibrinogen HS（Instrumentation  Laboratory,意大利,NO555339,ISI:1.30）、Thromberel S (Dade Berhing, 德国, 505797, ISI:0.95)。

    2  方    法

    2.1  在质控通过的情况下  选取当日在STAR上用Neoplastin CI plus测定的标本，根据通常的临床抗凝治疗INR目标值的不同，将不同INR水平的标本分为3组：小于1.5（48例，组1）、1.5～3（26例，组2）和大于3（23例，组3），换用Thromberel S试剂在STAR上调整相应ISI后测定标本；以同样方法在ACL Advance上测定上述标本；在CA7000上仅使用配套的Thromberel S试剂检测。上述过程在采血后3 h内完成。

    2.2  校准方法  PTmulti calibrator试剂盒提供6个水平的定标血浆（Thromberel S只使用前5支），标明了在使用Dade Berhing系列试剂的条件下，每支血浆在不同仪器上的凝血酶原活动度（%）和INR值。将其上机测得的PT（纵坐标）与对应的INR（横坐标）绘出一条对数曲线（图1），根据WHO推荐的INR计算公式INR=(PT/MNPT)ISI，分别取对数log(INR)=ISI × [log(PT)log(MNPT)],推导后得到曲线方程log(PT)=（1/ISI）× log(INR)+log(MNPT)，因此，截距为log(MNPT本地)，斜率的倒数即ISI本地。

    2.4  统计学方法  将不同INR水平的标本在不同仪器上使用配套试剂测定的PT和INR，分别在组内进行相关分析后配对t检验，对于三台仪器均使用Thromberel S测定的结果经上述两种方法校正后的INR也使用配对t检验，并作相关性分析。

    3  结    果

    3.1  使用配套试剂时，组1在ACL Advance和STAR与CA7000上的检测结果具有一定相关性（P<0.001），但是相差显著（表1）。组2和3不具有相关性。表1中P值来自t检验。

    3.2  在ACL Advance和STAR上使用  Thromberel S检测PT，经过公式和曲线校正后的INR与CA7000测定的INR相比，相关性较好（图2，3）。ACL Advance使用Thromberel S检测时，公式和曲线校正的INR与CA7000比较具有良好的相关性，但是t检验P<0.001，表明ACL Advance在三个水平与CA7000之间的差异明显。STAR 与CA7000之间的相关性不理想，差异也没有统计学意义。表1  ACL Advance和STAR上不同试剂测定的INR与CA7000的比较

    4  讨    论

    对凝血检验应当树立检测体系的概念，该体系至少包括试剂和仪器两部分，因此传统上我们校正凝血活酶试剂的ISI，在方法学一致的情况下能够保证结果的一致性。然而，当仪器作为重要因素并存在较大差异时，仅仅提供试剂在某一特定仪器上的ISI，会出现ISI的偏差[3]。这时就需要确定本地“真实”的ISI。它包含了试剂种类和批号以及特定仪器组成的“体系”方面的因素。本文涉及的3种PT检测试剂均属主流产品，经多年实践证明其具有稳定性与准确性。但是在非配套使用时仍然出现了上述与仪器不匹配的现象。表1清晰地表明试剂替代后的结果与原体系可能具有良好的相关性，而同一标本测定结果之间的差异几乎是难以弥合的。实际工作中不一定如此组合使用，本文旨在说明不恰当使用替代试剂将造成的不良后果。一些用户往往忽视了INR使用的细节，影响了结果的准确性，在口服抗凝药的情况下显得尤为突出。我们首先应该意识到：来源种属不同的试剂很难具有可替代性。比如ACL Advance换用Thromberel S前后，组2和组3的结果与CA7000的差异明显较大，谷晓林等[4]也有同样结论。其次，两组数据相关性良好并不意味着没有差异，表现为相关性曲线具有较大截距。ACL Advance与CA7000使用Thromberel S时的测定结果就有非常好的相关性（表1），但是差异显著；就是说即使方法学接近的不同仪器使用替代试剂，也会导致检测体系偏离原来的参考范围，偏离程度过高有可能超出临床接受范围。此外，由于PTmulti calibrator附带的说明书并没有指定针对STAR的PTINR，因此本文未获得理想的校正结果；与ACL Advance相比，表1或许能够提示我们：系统定标血浆的使用也是应该严格控制的，特别是用于检测原理不同的机型时尤其如此。

    必须明确的是，本文不是要反对使用替代试剂，只要经过合理的体系校正，获得试剂在本实验室的ISI，进而保证INR的可靠性，即可实现等效替代。STAR使用Thromberel S后经过两种方法的校正，6组数据配对t检验的差异均不具有统计学意义（P>0.05, 表1），有效地提高了系统间的可比性。使用同一试剂的不同体系以同一方法校正后，其结果将更为理想。

    INR是WHO利用国际参考血浆（IRP）标定凝血活酶试剂后，手工测定PT时优化报告的一种方法和理念。INR是以MNPT（20例以上新鲜正常血浆PT的几何均数）为基础计算而来的，旨在降低检测体系之间PT的差异。在此基础上可以减少室间差异及提高报告的可比性。然而，将商品化凝血活酶在自动化凝血仪上检测标本时，原理发生了改变，这种校准方法的基础已经不复存在了，实践发现实验室间INR的波动仍然较大[5]。这时我们校准的不仅仅是凝血活酶，而是检测体系—包括凝血活酶和检测技术（仪器）的系统。为了形成INR标准化的指南性文件，国际血栓与止血学会(ISTH)的专项工作组做了很多工作。然而，目前对校准品的质量和类型还没有任何规范，也没有具体的校准方法供实验室参考。凝血活酶校准时要求使用参考品和试管倾斜方法判定结果，虽然PT的标准化基于新鲜正常血浆，但是使用新鲜血浆的方法繁琐、耗时而且昂贵。冷冻血浆的活性在低温下也难以避免活性减低，不利于准确报告PT；只有冻干血浆性能相对稳定，使用国际参考品定值后，才可以作为当前理想之选，但是冻干和定值工作却不适于实验室独立完成。商品化体系定标血浆的优势在于：制造商根据国际参考品委员会的要求，使用WHO推荐方法对冻干血浆加以校准，用该制品可以计算当前批号试剂在本地体系中对应的ISI和MNPT值。

    近年来，进口试剂通常提供试剂与一系列不同仪器组合时的ISI，但是国内产品情况有所不同。实验表明，标定后的ISI与原ISI之间差异的产生主要在于是否使用了体系特异的ISI，如果是体系特异的，那么该差异会远小于厂家标示值而可以忽略，否则差异越大影响越大，因此在选择仪器和试剂时应该考虑这个因素。本实验使用的冻干血浆提供了CA7000与Thromberel S组合使用时的相应INR值，用以对该体系校准。笔者将其扩展应用，探索了冻干血浆进行体系校准的优势，发现这种方法可以建立本地ISI并通过修改检测程序而提高测定值的准确度；或者绘制PTINR对数曲线，曲线校正有助于摆脱试剂标示ISI与检测体系不匹配的困扰，直接得到更为准确的INR[68]。因此，在室间质评时，PTINR曲线校正后报告结果能够减少室间的INR差异。

    体系定标（或校准）自2002年提出以来，国外研究已经证实可以改善INR检验报告的准确性，其计算方法在多种试剂和仪器平台上应用简单有效。PTINR曲线比本地标定ISI的方法在INR准确性和室间精密度上更为完善。尽管这种方法还没有被普遍的接受，但是，作为一种科学理念和可行的手段，不失为解决目前临床止血和血栓检验体系多样性的参考方案。

【参考文献】[1] ADCOCK DM, JOHNSTON M. Evaluation of frozen plasma calibrants for enhanced standardization of the international normalized ratio (INR): a multicenter study［J］. Thromb Haemost，2002，87:7479.

[2] THROMB HAEMOSRWEATHER RB, ANSELL J, VAN DEN BESSELAAR AM, et al. College of American Pathologists Conference XXXI on laboratory monitoring of anticoagulant therapy: laboratory monitoring of oral anticoagulant therapy［J］. Arch Pathol Lab Med，1998，122(9):768781.

[3] 杨俊 邓新立 丛玉隆.仪器对凝血酶原时间国际标准化比值的影响及校正［J］. 临床检验杂志，1998,16(2):8990.

[4] 谷小林,彭明婷,王薇，等.四种凝血活酶试剂的比较［J］.陕西医学检验，2001，16(4):1112.

[5] KITCHEN S, JENNINGS I, WOODS TAL, et al. Local calibration of international normalised ratio improves between laboratory agreement: results from the UK national external quality assessment scheme［J］. Thromb Haemost，1999，81（1）: 6065.

[6] HOUBOUYAN LL, GOGUEL AF. Longterm French experience in INR standardization by a procedure using plasma calibrants［J］. Am J Clin Pathol，1997，108:8389.

[7] BRIEN WF, BASKERVILLE JC, TABERNER DA,et al.Calculation vs calibration curve for INR determination. Results of an interlaboratory proficiency scheme［J］. Am J Clin Pathol，1999，111(2):193201.