出血性血小板病患者凝血酶受体GP Ib/IX/V复合物表达研究

作者：沈霖,沈迪,陈 瑞，朱 闽，卢芙蓉,秦 铀，范 恒    作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科，武汉     【摘要】  目的 观察出血性血小板病患者的血小板膜糖蛋白（GP）Ib/IX/V复合物及其组分GP Ibα的表达。方法 采用流式细胞术检测68例出血性血小板病患者在出血期的血小板GP Ib/IX/V复合物和GP Ibα的表达，采用比浊法检测其血小板最大聚集率（MA），并与33例出血控制者及32例正常健康者比较。结果 出血性血小板病患者在出血期间GP Ib/IX/V复合物、GP Ibα表达明显低于正常组（P均<0.01）,出血控制者的 GP Ib/IX/V复合物、GP Ibα表达与正常组比较无显著性差异(P均>0.05)。结论 血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物作为凝血酶和血管性血友病因子的受体，在出血性血小板病患者体内的表达下降，导致血小板聚集功能障碍，可能是本病反复发作出血倾向的重要原因之一。

    【关键词】  出血性血小板病； 凝血酶受体； 血小板聚集功能

    Expression of Platelet Membrane Glycoprotein Ib/IX/V , a Platelet Membrane

    Receptor, in Patients with Hemorrhagic Thrombopathy

    SHEN Lin, SHEN Di, Chen Rui, ZHU Min, LU Furong, QIN You, FAN Heng

    Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, the Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022, China

    Abstract： Objective  To investigate the expression differences of platelet membrane glycoprotein (GP) Ib/IX/V complex and its component GP Ibα between patients with hemorrhagic thrombopathy and healthy subjects. Methods  The expressions of GP Ib/IX/V complex and GP Ibα were assessed by flow cytometry, and platelet maximum agglutination (MA) was determined by turbidity method in 68 bleeding patients with hemorrhagic thrombopathy and were compared with those in 33 bleeding controlled patients with hemorrhagic thrombopathy and 32 normal healthy subjects. Results  The mean fluorescence intensity of GP Ib/IX/V complex and GP Ibα were lower in bleeding patients with hemorrhagic thrombopathy than those in the healthy subjects(P<0.01), and there were no significant differences in the bleeding controlled patients with hemorrhagic thrombopathy and normal healthy subjects(P>0.05). Conclusion  As a receptor of thrombin and von Willebrand factor, GP Ib/IX/V complex decreased in hemorrhagic thrombopathy patients, resulting in platelet aggregation dysfunction, which might partly explain the repeatedly paroxysmal hemorrhagic tendency in hemorrhagic thrombopathy.

    Key words：  Hemorrhagic thrombopathy;  Receptor of Thrombin; Platelet aggregation

    出血性血小板病是一组反复发作性的出血性疾病。既往的研究表明，本病患者血小板聚集功能存在缺陷，且血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb/Ⅲa低于正常(1，2)。血小板GP Ib/IX/V复合物是血小板膜表面主要的糖蛋白分子之一，既是血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）的受体，又是凝血酶受体[3]，在血小板黏附和聚集中发挥着重要作用。本研究采用流式细胞术（flow cytometry, FCM）检测出血性血小板病患者血小板GP Ib/IX/V复合物及其组分GP Ibα的表达，观察其与出血控制者及正常人之间的差异，以探讨凝血酶受体变化在本病出血倾向中的意义。

    1  对象与方法

    1.1  入选标准  本组病例均按1996年标准选择(4)。全部病例均有多部位出血临床表现，经血小板计数、出血时间、凝血象(包括活化的部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间)检测未发现明显异常改变。按常规操作检测患者血小板聚集最大聚集率，其中最大聚集率在21％～40％者为反应不良，低于20％者为反应缺如。本组纳入病例均对一项或多项诱聚剂诱导的聚集反应不良或缺如。根据出血部位，经内科、耳鼻喉科、妇科、口腔科和眼科等科室诊视，未发现特异诊断性病灶，患者血压、心率正常。且均经瑞斯托霉素(ristocetin)检测，排除血小板无力症。

    1.2  对象及分组  101例出血性血小板病患者均为2004年8月～2008年3月间我院中西医结合科门诊及住院就诊或复查的病人。患者及其家属对本实验知情同意。根据出血性血小板病出血控制情况，分为出血性血小板病出血组68例，男25例，女43例，年龄13～61岁，平均33.58±15.34岁，病程1～12年。68例共计121个出血部位，其中肢体皮肤瘀班或瘀点53例，鼻出血21例，月经过多(每次月经量估计在150 ml以上者)20例，齿龈出血17例，眼底出血6例，球结膜出血4例。出血性血小板病出血控制组33例，经治疗出血症状控制，且随访半年以上未复发者，男14例，女19例，年龄33.28±10.42岁。另选本院体检中心健康体检者32例作为正常对照组，男15例，女17例，年龄34.21±7.14岁，所有受检者外周血小板计数均大于50×109/ L，在检查前两周内，均未服用阿司匹林、潘生丁、肝素以及活血化瘀类中药等影响血小板功能的药物。

    1.3  主要材料与仪器  藻红素（phycoerythrin, PE）标记的GP Ibα单克隆抗体CD 42b为美国BioLegend公司产品。GP Ib/IX/V复合物单克隆抗体CD 42abcd为美国ALEXIS公司产品。异硫氰酸荧光(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记二抗为美国KPL公司产品。血小板诱聚剂二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）、花生四烯酸(arachidonic acid，AA),血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)均为美国Sigma公司产品。FACS 420型流式细胞仪（美国BectonDickison公司），Chronolog 430型血小板聚集仪（美国Chronolog公司），台式低速离心机（德国eppendorf公司）。

    1.4  血小板聚集率测定  将3.8％枸橼酸钠抗凝后全血在台式低速离心机上以900 r/min离心10 min，取上清即为富血小板血浆（platelet rich plasma, PRP）。将剩下部分以3 800 r/min再次离心5 min，取上清即为乏血小板血浆（platelet poor plasma, PPP）。用PPP平衡血小板聚集仪，然后以ADP（终浓度1.90μmol/L）、AA（终浓度0.37 μmol/L)、PAF（终浓度150 nmol/L)作为血小板诱聚剂，加入PRP中,在血小板聚集仪上检测血小板最大聚集率（maximum agglutination， MAR）。

    1.5  GP Ib/IX/V及Ibα检测[4]  采用真空采血管（美国BD公司），经肘正中静脉采集清晨空腹静脉血3 ml，以3.8％枸橼酸钠抗凝，血液与抗凝剂的比例为9∶1。将抗凝后全血，以1％多聚甲醛固定45 min。取50 μl加至流式检测管，后分别向不同管中加入20 μl GP Ib/IX/V 复合物单克隆抗体CD 42abcd和PE标记的GP Ibα单克隆抗体CD 42b，混匀室温避光孵育30 min，然后CD 42abcd标记的样本中加入20 μl FITC标记的羊抗鼠IgG,混匀室温避光孵育30 min。用0.2 M PBS定容至500 μl，于FACS 420型流式细胞仪上检测，每个样本分析10 000个血小板，结果以平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)表示。

    1.6  统计学分析  采用SPSS统计软件处理,组间比较采用ｔ检验。采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差（x±ｓ）表示，组间比较用成组t检验，P<0.05认为有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  血小板聚集功能测定结果  出血性血小板病出血组68例中，单独一种诱聚剂诱导缺陷者：ADP 12例，AA 10例，PAF 5例；2种诱聚剂同时出现聚集缺陷者：ADP／AA 11例，ADP／PAF 10例，AA／PAF 14例；3种诱聚剂ADP／AA／PAF聚集缺陷者6例。出血性血小板病出血控制组33例中，ADP 2例，AA 1例，PAF 2例，AA／PAF 1例。正常对照组血小板聚集检测无异常发现。

    2.2  各组血小板GP Ib/IX/V复合物、GP Ibα MFI的比较  见表1。出血组GP Ib/IX/V复合物、GP Ibα MFI明显低于正常组，两组之间的差异有统计学意义（P=0.012,P=0.001）。表1  出血性血小板病患者与正常人注：与正常组比较，*P<0.05

    3  讨    论

    血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物是主要的GP分子之一，包括4种成份：GP Ibα、GP Ibβ、 GP Ⅸ和GP Ⅴ。最新研究表明，它们按2∶4∶2∶1的比例结合成一个复合物[5]，具有凝血酶受体功能[5]。凝血酶是一个多功能血浆丝氨酸蛋白酶，它能活化血小板使之发生聚集[5.6]。研究证实[7]，血小板活化时，原先均匀分布在血小板膜表面的GP Ib/IX/V复合物，迅速转运到开放管道系统(OCS)膜集中分布，使血小板膜表面分布减少，使血小板发生黏附、聚集和释放反应。同时，GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ又是血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）的受体[8]。GP Ib/IX/V复合物在高剪切率下与其配体vWF结合，介导血小板与胶原结合，形成止血和血栓形成的始动环节，进而产生血小板黏附、聚集，并被活化，活化后的血小板释放大量活性物质如ADP等，导致血小板聚集。GPⅠbα是GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物的组成部分之一。很多资料表明，GP Ibα是凝血酶和vWF的高亲和力结合位点[8,9，10]。

    本研究显示，出血性血小板病患者在出血期间GP Ib/IX/V复合物及其组分GP Ibα表达明显低于正常对照组。由此分析，本病血小板膜GPⅠbα降低引起GP Ib/IX/V降低，凝血酶及vWF不能与之有效结合是导致临床出血，血小板聚集不良或异常的原因之一。尽管该病患者血小板膜GP降低，是GP表达异常，还是结构或功能异常，尚不能确定。但从本研究显示的患者在出血控制，血小板聚集功能恢复正常后，GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ及GPⅠbα表达也与正常组比较无显著性差异，表明本病GP表达下降可能仅仅是功能异常，是可逆的。前期有报告提示，出血性血小板病GP蛋白表达异常可能是体内有某种物质遮盖了GP分子上的受体结合部位所致[11]。其确切机理有待进一步探讨。

【参考文献】［1］  沈霖，沈迪.出血性血小板病患者膜糖蛋白表达的研究［J］.血栓与止血学,2005,11（2）：5760.

［2］ SHEN LIN,SHEN DI,LU FURONG, et al. Comparison of the Changes in Platelet Membrane Glycoproteins between Patients with Hemorrhagic Thrombopathy and Healthy People［J］. Journal of Clinic Rehabilitative Tissue Engineering Research， 2007，11(11):21822184.

［3］ ROTH GL. A new kid on the platelet thrombin receptor block: Glycoprotein IbⅨV［J］. PNAS，2001，98,13301331.

［4］ 沈迪，凌柱三.临床出血病学［M］.北京：科学技术文献出版社，1996：4345.

［5］ LUO SZ, MO X, AFSHARKHARGHAN V, et al. Glycoprotein Ibα forms disulfide bonds with 2 glycoprotein Ib subunits in the resting platelet［J］. Blood，2007，109(2):603609.

［6］ SAKRAI Y, SHIMA M, GIDDINGS J, et al. A critical role for thrombin in platelet aggregation under high shear stress［J］.Thromb Res，2004，113(5):311318.

［7］ DONG JF, GAO S, LOPEZ JA. Synthesis, assembly, and intracellular transport of the platelet glycoprotein IbIXV complex［J］.J Biol Chem，1998，273(47):3144931454.

［8］ SHEN Y, ROMO GM, DONG JF, et al. Requirement of leucinerich repeats of glycoprotein (GP) Ibalpha for sheardependent and static binding of von Willebrand factor to the platelet membrane GP IbIXV complex［J］.Blood，2000，95(3):903910.

［9］ ADAM F, BOUTON MC, HUISSE MG, et al. Thrombin interaction with platelet membrane glycoprotein Ib alpha［J］. Trends Mol Med，2003，9:461464.

［10］ SOSLAU G, CLASS R, MORGAN DA, et al. Unique Pathway of Thrombininduced Platelet Aggregation Mediated by Glycoprotein Ib［J］.J Biol Chen，2001，276(24):2117321183.

［11］ SHEN LIN, SHEN DI, GAO LAN, et al. Effect of Xiaoyu Zhixue Tablet on Expression of Platelet Membrane Glycoproteins in Patients with Hemorrhagic Thrombopathy［J］. Chinese Journal of Integrative Medicine, 2004，10(3):170174.