冠心病患者抗凝、纤溶功能及单核细胞上CD 40CD 40L系统表达的研究

作者：刘丽，刘敏涓*，罗承峰，周旭红，冯 莹    作者单位：广州医学院荔湾医院 肿瘤科，广州     【摘要】  目的 观察冠心病（CHD）患者抗凝、纤溶功能及单核细胞上CD 40CD 40L系统表达情况以及两者间的相关性。方法 将36例CHD病例分为2组：心绞痛（SA）组和冠脉综合征（ACS）组，分别检测血浆中PC活性、Ddimer（DD）、tPA、PAI1含量、游离型配体sCD 40L浓度和外周血单核细胞上CD 40、CD 40L表达水平，并与19例正常对照组相比较。结果 ACS组、SA组患者血浆PC活性明显低于健康对照组；ACS组、SA组患者血浆DD含量明显高于健康对照组；ACS组、SA组患者血浆tPA含量明显高于健康对照组；ACS组患者血浆PAI1含量明显高于SA组、健康对照组；ACS组患者外周血单核细胞上CD 40的表达水平明显高于SA组、健康对照组；ACS组、SA组患者血浆sCD 40L浓度明显高于健康对照组（P<0.05）；外周血单核细胞CD 40与CD 40L表达水平与血浆sCD 40L浓度三者间进行Pearson相关系数分析，结果显示外周血单核细胞CD 40与CD 40L表达水平呈正相关（r=0.41，P=0.002）；外周血单核细胞CD 40表达水平与血浆sCD 40L浓度呈正相关（r=0.367，P=0.006）；血浆PAI1含量与外周血单核细胞CD 40表达水平、血浆sCD 40L浓度呈正相关（r=0.328，P=0.014；r=0.401，P=0.002）。结论 CHD患者抗凝、纤溶功能对评估CHD的预后、指导治疗有一定的价值。CD 40CD 40L通路可能与ACS的形成有关，阻断CD 40CD 40L信号途径可能成为防治AS的一个重要靶点。

    【关键词】  冠心病 ; 蛋白C; D二聚体; 纤溶酶原; CD 40

     Study on AnticoagulantFibrinolytic Function and Expression of CD 40CD 40 Ligand System on Monocytes in Patients with Coronary Heart Disease

    LIU Li，LIU Minjuan，LUO Chengfeng，ZHOU Xuhong，FENG Ying

    （Department of Oncology，the Liwan Hospital of Guangzhou Medical College , Guangzhou 510170， China)

    Abstract： Objective  To investigate anticoagulantfibrinolytic function and expression of CD 40CD 40 ligand system on monocytes and the correlation between two system in patients with coronary heart disease. Methods  36 CHD patients was divided two groups：stable angina(SA), acute coronary syndrome(ACS).（CHD） In these patients, activity of plasma PC, contents of plasma Ddimer（DD）, tPA and PAI1，concentrates of plasma soluble CD 40 ligand(sCD 40L)，the expression level of CD 40 and CD 40L on peripheral blood mononuclear cells(PBMC), was detected, and was compared with 19 health adult. Results  The activity of plasma PC in patients with CHD was significantly lower than healthy controls. The contents of plasma DD in patients with CHD was significantly higher than healthy controls. The contents of plasma tPA in patients with CHD was significantly higher than healthy controls. The contents of plasma PAI1 in patients with ACS was significantly higher than patients with SA and healthy controls. The expression of CD 40 on PBMC in patients with ACS was significantly higher than patients with SA and healthy controls. The concentrates of plasma sCD 40L in patients with CHD was significantly higher than healthy controls(P<0.05). There was positive correlation of the expression of between CD 40 and CD 40L on monocytes in peripheral blood(r=0.41，P=0.002);there was positive correlation between the expression of CD 40 on monocytes in peripheral blood and concentrations of sCD 40L in plasma(r=0.367，P=0.006);there was positive correlation between the contents of plasma  PAI1 and the expression of CD 40 on monocytes in peripheral blood,concentrations of sCD 40L in plasma(r=0.328，P=0.014; r=0.401，P=0.002). Conclusion  Study of the anticoagulantfibrinolytic function in CHD patients had a certain value to assess prognosis and guide treatment of CHD. CD 40 CD 40L pathway may correlate with the formation of ACS，blockade of CD 40CD 40L system may be an important target for prevention and cure of AS.

    Key words：  Coronary heart disease; Protein C; Ddimer; Plasminogen; CD 40

    冠心病(CHD) 95%～99%由于动脉粥样硬化(AS)所致。病变损伤血管内膜，使局部凝血、抗凝和纤溶功能发生不同程度改变，是导致冠状动脉内血栓形成的重要原因之一。许多研究显示炎症与免疫在AS的发生、发展中起重要作用[1] 。冠状动脉粥样硬化斑块内的炎症反应促使冠状动脉内不稳定斑块的形成和破裂, 在此基础上发生细胞成分的活化并介导血栓形成导致急性冠脉综合征（ACS）的发生[2]。本文通过对冠心病患者抗凝、纤溶功能及单核细胞上CD 40CD 40L系统表达的研究，观察其变化情况及相互间的相关性。

    1  对象和方法

    1.1  一般资料

    1.1.1  研究对象  CHD病例36例，全部为2006年8月至2007年2月在广州医学院第二附属医院心内科的住院病例。诊断标准依据内科学第6版（叶任高、陆再英主编）CHD的分型标准。根据病史、临床表现及心电图、心电图负荷试验、心脏超声心动图、心肌酶学检查、冠状动脉造影等综合分析，将确诊为CHD的患者纳入实验组。将36例CHD病例分为2组：心绞痛（SA）组和ACS组。SA组患者16例，男性 7例，女性9例，平均年龄60（46～79）岁；ACS组患者20例，不稳定型心绞痛（unstable angina pectoris,UAP）14例，急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）6例，20例病人中，男性8例，女性12 例，平均年龄59（40～77）岁。所有CHD病例均为新近诊断或既往确诊为CHD，近期内未服用过抗血小板药物如阿司匹林或其它抗凝药及调脂类药物，未曾行冠状动脉介入治疗（PCI），无严重的肝肾功能不全、感染性疾病及免疫系统、血液系统疾病等。

    1.1.2  健康对照组  19例，其中男性8例，女性11 例，平均年龄54（28～60）岁。经病史询问无心血管疾病史，体格检查无阳性体征，心电图、胸片及肝肾功能、生物化学常规检查无异常者。三组间性别和年龄无显著性差异。

    1.2  标本采集与检测方法  所有标本均在治疗前获得。取空腹静脉血4 ml，分成2份，分别置于含EDTA.K2抗凝液和柠檬酸钠抗凝液（1∶9）的试管中。将含柠檬酸钠抗凝液（1∶9）的试管置于水平离心机中，3 000 r/min离心10 min，收集上清液（血浆，黄色），分装于500 μl Eppendorf 管，迅速于-80℃保存。血浆中PC活性、DD、tPA、PAI1含量、sCD 40L浓度用ELISA试剂盒进行检测，操作过程严格按照说明书进行。单核细胞上CD 40和其配体CD 40L的表达水平用流式细胞仪（Beckman Coulter EPICSXL 流式细胞仪，Beckman Coulter Company，美国）进行检测；

    1.3  统计学处理  所得的数据均用均数±标准差（x±s）表示，用SPSS 11.5统计软件进行分析。计量资料采用独立样本t检验；不同指标间的相关性用Pearson相关系数进行分析。P<0.05为差异有显著性。

    2  结    果

    2.1  血浆中PC活性、DD、tPA、PAI1含量  见表1。表1  血浆中PC活性、DD、tPA、PAI1含量 *与对照组比较；▲与SA组比较，P<0.05

    2.2  外周血单核细胞上CD 40、CD 40L表达、血浆sCD 40L浓度，见表2。表2  外周血单核细胞上CD 40、CD 40L表达、血浆sCD 40L浓度*与对照组比较；▲与SA组比较，P<0.05

    2.3  抗凝、纤溶指标及单核细胞上CD 40CD 40L系统各指标间的相关性分析  血浆PAI1含量与外周血单核细胞CD 40表达水平的相关系数是r=0.328，P=0.014；血浆PAI1含量与血浆sCD 40L浓度的相关系数是r=0.401，P=0.002；PAI1含量与CD 40L及血浆PC活性、DD、tPA含量与CD 40CD 40L系统间未发现具有明显的相关性。

    2.4  CD 40、CD 40L表达水平和血浆sCD 40L浓度的相关性分析  外周血单核细胞CD 40与CD 40L表达水平的相关系数是r=0.41，P=0.002；外周血单核细胞CD 40表达水平与血浆sCD 40L浓度的相关系数是r=0.367，P=0.006；外周血单核细胞CD 40L表达水平与血浆sCD 40L浓度的相关系数r=0.235，P=0.085。

    3  讨    论

    CHD患者由于AS病变损伤血管内膜，使局部凝血、抗凝和纤溶功能发生不同程度改变，是导致冠状动脉内血栓形成的重要原因之一。

    PC为蛋白质C系统的关键成分。低浓度凝血酶即可激活PC为APC。APC具有显著的抗血栓功能，对血液的凝固起重要的调节作用[3]。本实验研究结果说明CHD患者体内抗血栓形成能力降低，存在血栓前状态。

    血浆DD被认为是反映体内纤溶激活及纤维蛋白形成的敏感、特异性的指标，其含量增高反映继发性纤溶活性增强和凝血酶生成增加，是一项提示体内高凝状态及血栓形成的有价值的指标。CHD患者DD水平持续升高，则其血栓形成的危险性增高。

    tPA是纤溶系统主要的生理性激活剂。当循环中一旦出现纤维蛋白时，tPA分泌增多，能与血栓中的纤维蛋白特异性结合，在纤维蛋白凝块上高效地激活纤溶酶原生成纤溶酶，后者使纤维蛋白快速降解，使血栓溶解，使纤溶活性增加。内皮细胞、肝细胞、血小板等是PAI1的主要来源[4]。PAI1能迅速地以1∶1分子比例与tPA形成复合物而使tPA迅速失活，导致纤维蛋白清除下降。本实验研究结果显示，CHD患者血浆PAI1和tPA水平的异常变化，原因可能是由于PAI1异常升高，导致tPA代偿性释放增加，但增多的tPA大多与PAI1以及α2巨球蛋白、α2抗纤溶酶等抑制物结合并失去活性，真正具有活性的游离tPA反而减少，表现为tPA含量增加，活性却下降[5]。

    CD 40及其配体CD 40L是一对互补跨膜糖蛋白。CD 40CD 40L系统是炎症过程中重要的信号通路,位于细胞因子网络的上游，可调节多种炎症反应。它广泛表达于AS斑块的巨噬细胞、平滑肌细胞、T细胞等，其作用几乎贯穿了AS斑块发生、发展和破裂的全过程,可能是AS发病的关键环节[6]。无论是CD 40L的结合状态还是游离分子，均能与CD 40专一性特异性的结合，启动靶细胞的生物学效应。CD 40L的生物学效应多在与CD 40相互作用后产生，如促进与动脉粥样硬化相关的某些分子（细胞因子、黏附分子、TF和基质金属蛋白酶）的表达，活化动脉粥样斑块相关细胞，导致斑块扩大，破裂和血栓形成。体外研究已证实oxLDL及细胞因子IL1、INFγ、TNF均能明显刺激人的内皮细胞和单核细胞表达CD 40、CD 40L，并且抗氧化剂维生素E能抑制上述效应[7]。本文研究结果显示ACS患者外周血单核细胞上CD 40表达明显升高，且CD 40与CD 40L表达水平呈正相关。ACS患者CD 40L的表达水平虽高于其它两组，但并未发现具有显著性差异，可能与患者体内存在的刺激单核细胞高表达CD 40L的成分如oxLDL,细胞因子（IL1、INFγ、TNF）、炎症因子等的水平高低有关。因大多数CD 40分子在细胞上是固定表达，但CD 40L的表达与CD 40不同，多为诱导表达，而非持续性表达。但其详细机制并不清楚，尚有待进一步的研究。

    血浆PAI1与CD 40CD 40L系统具有相关性，分析原因可能与血小板的激活有关。其机理如下：（1） sCD 40L结构中包含KGD序列，后者可与血小板的GPⅡb/Ⅲa相结合，从而激活血小板。CD 40与CD 40L相互作用后，活化动脉粥样斑块相关细胞，导致斑块扩大，破裂，血小板在局部激活聚集，可从α颗粒内释放大量的PAI1，活化的血小板也可释放sCD 40L，使斑块更趋于不稳定或延迟愈合，形成恶性循环；（2） 当ACS发生时，机体处于应激状态，因此血中的儿茶酚胺含量有所增高，高水平的儿茶酚胺可促进血管内皮细胞释放PAI1，也可促进血小板释放PAI1[8]。由于本实验为小样本资料，对于抗凝PC、DD、tPA、PAI1与CD 40CD 40L系统的相关性仍需大样本资料进一步研究。

    本实验CD 40CD 40L系统各指标相关性研究结果显示，单核细胞上CD 40L的表达与血浆中sCD 40L浓度间未发现有相关性，提示血浆sCD 40L升高可能并不是单核细胞分泌入血所致。CD 40L虽可以在单核细胞上表达，但单核细胞并不是血浆中sCD 40L的主要来源。

    循环中的sCD 40L可与单核细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞表面的CD 40受体结合而发挥生物学效应，加剧炎症反应，使斑块更趋于不稳定或延迟愈合，形成恶性循环。本文相关性研究结果也显示外周血单核细胞上CD 40的表达水平与血浆sCD 40L浓度呈正相关。本文未发现三组间单核细胞上CD 40L的表达有明显差异，考虑原因可能与单个细胞上CD 40L的表达水平低，样本例数少有关。

【参考文献】[1] LIBBY P, RIDKER PM, MASERI A. Inflammation and atherosclerosis［J］. Circulation,2002,105:11351143.

[2] DIVIES MJ. The pathophysiology of acute coronary syndrome［J］. Heart J ，2000,83(3):361366.

[3] 刘泽霖，贺石林，李家增. 血栓性疾病的诊断与治疗［M］.北京：人民卫生出版社，2000.

[4] KOHLER HP. Plasminogenactivator inhibitor type 1 and coronary artery disease. N Engl J Med,2000,342(24):1792.

[5] 楚英杰，牛振民，王聪霞.冠心病患者胰岛素抵抗与纤溶活性的关系［J］.中华老年心脑血管病杂志，2000，2(2):8788.

[6] PHIPPS RP. Atherosclerosis: the emerging role of inflammation and the CD 40CD 40 ligand system. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:69306932.

[7] 史文元，唐朝克，杨永宗，等.CD 40CD 40L与斑块的不稳定性［J］.生命的化学，2004，24(3):224226.

[8] 李志安，王宝元，李岩.冠心病及脑梗塞与组织型纤溶酶原激活物及其抑制物关系的探讨［J］.河北医科大学学报，2002，23(2):100101.