雷公藤内酯醇洗脱支架抑制小型猪冠脉再狭窄研究

作者：林纲毅,陆东风*,杨镇军,吴婉如    作者单位：广州医学院第二附属医院心内科，广州     【摘要】  目的 评价雷公藤内酯醇洗脱支架对预防小型猪冠状动脉模型再狭窄的疗效，研究其量效关系与安全性。方法 将30只西藏小型猪分为不锈钢裸金属支架组、雷帕霉素支架组、雷公藤内酯醇60 μg支架组、雷公藤内酯醇100 μg支架组和雷公藤内酯醇200 μg支架组等5组，设立7 d组和28 d组两个观察终点。每只猪选择左前降支和右冠脉分别置入同一类型支架各1枚。共置入支架60枚。28 d组于术后28 d行冠状动脉造影，术后处死动物，取出支架血管，行病理组织学分析。7 d组于术后7 d处死动物，取支架血管行核因子NFκB免疫组化检测。所有小型猪术前术后行血常规和血肝肾功能检查。结果 支架植入后28 d组、雷公藤内酯醇100 μg支架组和雷帕霉素支架组最小内径相似（P＞0.05），均大于不锈钢裸金属支架组（P＜0.05）。雷公藤内酯醇100 μg支架组与雷帕霉素支架组相比新生内膜厚度相似（P＞0.05），均明显小于不锈钢裸金属支架组、雷公藤内酯醇60 μg支架组和雷公藤内酯醇200 μg支架组（P＜0.05）。雷公藤内酯醇100 μg支架组与雷帕霉素支架组相比狭窄程度相似（P＞0.05），均明显小于不锈钢裸金属支架组、雷公藤内酯醇60 μg支架组和雷公藤内酯醇200 μg支架组（P＜0.05）。支架植入后雷公藤内酯醇100 μg支架组NFκB阳性细胞数比不锈钢裸金属支架组、雷帕霉素支架组、雷公藤内酯醇60 μg支架组和雷公藤内酯醇200 μg支架组减少（P＜0.05），其它4组无统计学意义（P＞0.05）。结论 雷公藤内酯醇支架能抑制冠脉内膜增生，在支架植入4周内能预防再狭窄，无毒副作用，且其效应呈剂量依赖性。

    【关键词】  再狭窄； 药物洗脱支架； 雷公藤内酯醇

    The Effect and Mechanism of Triptolideeluting Stent on Preventing  Porcine Coronary Restenosis In Miniwine

    LIN Gangyi ，LU Dongfeng ，YANG Zhenjun，WU Wanru

    (Department of Cardiology, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510260, China)

    Abstract： Objective  To evaluate the effect of triptolide elutingstent on preventing instent restenosis in mini porcine models, and to investigate it’s doseeffect relationship and safety. Methods  30 Tibet mini porcine were randomly divided into five groups: bare metal stent group, rapamycineluting stent group, triptolideeluting stent 60 μg group, triptolideeluting stent 100 μg group and triptolideeluting stent 200 μg group. And two observe end points respectively 7 days and 28 days were set. Each of the animals was implanted one sametype stent into left anterior descending coronary (LAD) and right coronary artery (RCA) respectively. Those animals which observe end point is 28 days were performed coronary angiography and executed in the 28th day after implantation. And the stent implanted arteries were histopathology and histomorphometry analyzed. Those animals which observe end point is 7 days were also executed in the 7th day after the implantation. And immunocytochemistry analysis was performed to detect the expression NFκB（nuclear factorκB）protein in the stent implanted arteries. Functional parameters of liver and renal (ALT, AST and CREA) in all animals were checked before the implantation and when the animals were executed. Results  In the 28 days groups, the instent minimal lumen diameter of the rapamycin elutingstent group was similar to that of triptolide elutingstent 100 μg group (P>0.05), both of which were larger than that of bare metal stent group (P<0.05). The neointimal area of the troptolide elutingstent 100 μg group was similar to that of rapamycin elutingstent group (P>0.05), both of which were apparently smaller than the orther three groups(P<0.05). The lumen stenosis rate of the troptolide elutingstent 100 μg group was similar to that of rapamycin elutingstent group (P>0.05), both of which were apparently smaller than the orther three groups(P<0.05). Immunocytochemistry analysis results showed that compare with bare metal stent group, rapamycin elutingstent group , troptolide elutingstent 60 μg and 200 μg group the expression of NFκB protein was less in the troptolide elutingstent 100 μg group (P<0.05); and compare with each other the expression of NFκB protein in the first four groups was no statistic significance.Conclusion  Troptolide elutingstent can inhibit the proliferation of intimal, and exhibits a dose dependent effect on preventing instent restenosis within four weeks after the implantation.

    Key words：  Restenosis; Drug eluting stent; Triptolide

    药物涂层支架(drugeluting stent, DES)是新近出现的一种非常有前途的预防支架内再狭窄的方法，可使再狭窄率下降到10%以下,其临床应用已被视为介入技术治疗冠心病的第3次飞跃。目前支架植入后再狭窄过程可分为4个过程：① 血栓形成，② 炎症反应，③ 平滑肌细胞的迁移与增殖，④ 血管组织的弹性恢复[1]。雷公藤内酯醇具有抗炎、免疫抑制及抗肿瘤抗增殖的作用。本研究拟建立雷公藤内酯醇药物洗脱支架60 μg，100 μg和200 μg组3个剂量组，探讨雷公藤内酯醇洗脱支架对预防再狭窄的有效性，筛选出合适的剂量，为国产药物洗脱支架的进一步研制和临床应用提供实验依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  30只国内西藏小型猪，雄性，4～6月龄，体重20～25 kg。随机分为裸支架组、雷帕霉素支架组、雷公藤内酯醇支架60 μg组、雷公藤内酯醇支架100 μg和雷公藤内酯醇支架200 μg组各6只。其中28 d观察终点组每组4只。7 d观察终点组每组2只。

    1.2  实验器材和主要试剂  实验支架由我方和上海微创共同研制。不锈钢裸支架、雷帕霉素支架、雷公藤内酯醇洗脱支架（60 μg，100 μg和200 μg），型号均为2.5×23 mm。药物支架预装在球囊导管上。NFκB抗体和SP免疫组化试剂盒由晶美生物工程有限公司提供。

    1.3.1  方法  支架植入：实验动物猪术前口服阿司匹林0.3 g, 氯吡格雷75 mg。小型猪猪麻醉后切开皮肤,分离皮下组织, 暴露右股动脉后穿刺, 置入6F 动脉鞘，予200 u/kg肝素钠抗凝。造影, 定量冠状动脉造影测定血管直径, 取左前降支和右冠状动脉血管为支架植入部位，植入同一类型支架各1枚。使用左或右指引导管将0.014″超软导丝送至靶血管远端, 根据参考血管直径, 用带支架球囊以球囊/ 血管直径1.1～1.2∶1 的比例, 用10～15个大气压、15～20 s 扩张支架。支架释放后,再次行选择性冠状动脉造影, 依次退出球囊、导丝、指引导管。拔出动脉鞘, 结扎股动脉并缝合伤口。术后3 d肌注庆大霉素80万u预防感染。术后予阿司匹林150 mg/d、氯吡格雷37.5 mg/d口服。

    1.3.2  血管造影  支架植入后7 d或28 d后动物行冠状动脉造影检查。麻醉动物后经左股动脉切开，置入动脉鞘。动脉鞘处抽血用肝素抗凝管保存送检验科行血常规和肝肾生化检查（ALT、AST、CREA），使用右冠状动脉造影管行冠脉造影，采用造影机自带软件（QCA）测定邻近正常血管腔直径、管腔最小直径和计算狭窄程度（与邻近正常血管腔相比），连续测量3次，计算平均值。

    1.3.3  组织病理学检查  实验动物猪复查冠状动脉造影后处死, 取出心脏, 10%中性缓冲福尔马林以70 mmHg压力从主动脉根部灌注固定20 h, 分离支架及支架10 mm 内的血管段。硬塑料包埋后, 硬组织切片机切片。根据Schwartz[ 2] 描述的方法, 电脑微图像分析仪测定支架段血管的外弹力膜面积、内弹力膜面积、管腔面积、内膜面积和新生内膜面积及计算狭窄程度 ( 狭窄程度=新生内膜面积/ 内弹力膜面积) 。

    1.3.4  免疫组化检测  标本经石蜡包埋,切片,用SP法检测。抗体为NFκB。抗原修复为微波修复, DAB显色, 同时做不加一抗而其他条件均相同的阴性对照。每个切片任取5个高倍视野(×400)计数阳性细胞数,将阳性细胞数累计后取平均值作为每只动物的阳性细胞数。

    1.3.5  安全性检测  支架植入前及复查冠状动脉造影前取实验动物外周血行血常规和血肝肾功能检查（ALT、AST、CREA）。

    1.4  统计学处理  所有数据采用均数±标准差表示，采用SPSS 15.0软件进行分析。组间均数采用SNKq检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  血管造影定量结果  见表1。表1  28d组血管造影定量结果 注：表1为5组支架术后28 d组血管造影定量结果。雷公藤内酯醇100μg组与雷帕霉素组比较*P＞0.05，与裸金属支架组、雷公藤内酯醇60μg组、雷公藤内酯醇200μg相比△P＜0.05。

    2.2  组织病理学结果  见表2。 表2  28d组病理组织学检测结果注：表2为5组支架术后28 d组血管造影定量结果。雷公藤内酯醇洗脱支架100μg组与雷帕霉素洗脱支架组比较*P＞0.05，与裸金属支架组、雷公藤内酯醇洗脱60μg组、雷公藤内酯醇洗脱支架200μg相比△P＜0.05。

    2.3  免疫组化检测结果  见表3。表3  7d组免疫组织化学检测结果注：雷公藤内酯醇洗脱支架100μg组与其它4组比较*P＜0.05。其它4组相比P＞0.05。

    2.4  雷公藤内酯醇洗脱支架安全性检测结果  手术前与手术后7 d组、28 d组抽血比较血白细胞、红细胞、血红蛋白、血丙氨酸转氨酶、血天冬氨酸氨基转氨酶、血肌酐无统计学意义（P＞0.05），动物处死后重要脏器大体形态及病理学检查证实无炎症反应及坏死。见表4。表4  7d组、28d组术前与术后抽血结果 注：各组相比P＞0.05。

    3  讨    论

    本实验结果表明，雷公藤内酯醇洗脱支架在小型猪冠脉再狭窄模型可有效抑制冠脉内膜增生，预防再狭窄，其中100 μg组较60 μg组和200 μg组抑制内膜增生作用效果好，其抑制作用呈剂量依赖性，安全性检测显示未发现毒性反应。本实验7 d观察终点组还观察到了雷公藤内酯醇具有抑制NFκB的作用。

    雷公藤内酯醇是从中药雷公藤中分离提纯出来的一种三氧二萜内酯化合物单体，是其主要活性成分之一，具有抗炎、免疫抑制及抗肿瘤抗增殖的作用。我们发现雷公藤内酯醇以一种剂量依赖性的方式抑制了血管平滑肌细胞的增殖，它显著增加细胞周期中G0/G1期细胞百分含量，减少S期细胞的百分含量，阻断细胞由G0/G1期向DNA合成的S期转化，提示雷公藤内酯醇通过影响细胞周期的转化而抑制血管平滑肌细胞的增殖[3]。我们将雷公藤内酯醇药物洗脱支架（剂量浓度为120 μg和200 μg）植入猪的冠状动脉中，以植入雷帕霉素洗脱支架和不锈钢裸金属支架的猪做对照，结果显示支架植入后4周，雷公藤内酯醇洗脱支架在猪支架内再狭窄模型中预防再狭窄的作用与雷帕霉素洗脱支架相似，均优于裸支架组 [4，5] 。本实验于小型猪冠脉内置入裸金属支架，雷帕霉素支架，雷公藤内酯醇60 μg支架、100 μg支架和200 μg支架等5个组，观察其有效性和安全性，于28 d后行冠脉造影和病理组织检查，结果显示，雷公藤内酯醇100 μg组能减少新生内膜的增生，预防再狭窄，其有效性与雷帕霉素支架组相似，优于裸支架组、雷公藤内酯醇60 μg组和雷公藤内酯醇200 μg组，而雷公藤内酯醇药物洗脱支架60 μg组和200 μg并未能显示出良好的抑制内膜增生、预防再狭窄的作用。我实验组曾研究发现雷公藤内酯醇以剂量依赖的方式抑制平滑肌细胞的增生，雷公藤内酯醇60 μg组与裸支架组结果相似，考虑与剂量偏小，未达足够药物浓度有关。而200 μg组预防再狭窄效果比裸支架组好，但比100 μg组差，同时亦提示超过200 μg这个药物浓度可能会失去预防再狭窄的作用或产生毒性反应。有研究表明，静脉注射雷公藤内酯醇可诱导小鼠和兔血栓性浅静脉炎，且发现雷公藤内酯醇引起的静脉炎与浓度有依赖关系,这种炎症反应导致血小板白细胞和纤维蛋白沉积而形成血栓[6]。现今支架内血栓的发生率引起了临床医生的重视。经过对金属裸支架、雷帕霉素涂层支架、聚合物的材料的紫杉醇药物涂层支架的对比研究,发现植入药物涂层支架患者有较高的晚期支架内血栓形成发生率[7] 。关于晚期仍形成支架内血栓的机制,目前认为是DES植入后血管再内膜化的延误或不完整,也可能是对支架聚合物的一种炎性反应[ 8] 。还可能有其他一些因素,如支撑的断裂和支架放置的位置不妥等。雷公藤内酯醇在一定剂量时具有抗血小板的作用，且其具有抗炎作用，因此其是否有抗支架内血栓的作用还需进一步探讨。血液常规、生化和组织病理学检查未见对血液系统、肝功能、肾功能及组织器官造成损害, 尽管观察时间短, 但也提示了雷公藤内酯醇洗脱支架的安全性。

    NFκB是一种能调控多种基因的具有多种效应的转录因子。NFκB已被证实参与动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄和其它血管增殖性病变等病理生理过程[9]。NFκB激活后促进平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞中的黏附分子、细胞因子、生长因子、环氧化酶、单核细胞趋化因子等的基因表达。在白细胞黏附分子和内皮细胞黏附分子的介导下,内皮与血中单核细胞、淋巴细胞、血小板黏附,单核细胞迁移进入内皮下形成巨噬细胞,并吞噬脂质后成为泡沫细胞。同时平滑肌在血小板源性生长因子(PDGF)和纤维生长因子 (FGF)及转移生长因子β (TGFβ)介导下向内膜下迁移增生,从而造成内膜增生、管腔狭窄[10] 。雷公藤内脂醇能抑制细胞内NFκB的活性[1113] 。本实验观察到了雷公藤内酯醇100 μg支架组抑制了NFκB的表达，且相比其它4组能更好地抑制NFκB的表达，因此证明了雷公藤内酯醇能通过抑制NFκB，从而减轻炎症反应，进一步抑制内膜的增生，起预防再狭窄的作用。

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