颈动脉支架置入术后循环血小板活化和聚集的系列变化

作者：刘芳，王大明，刘加春，李 金,许晓东,郝洪军　黄一宁    作者单位：北京大学第一医院神经内科 北京100034     【摘要】  目的 观察颈动脉支架置入术（CAS）后1周内血小板活化指标和聚集功能的系列变化。方法 20例症状性颈动脉狭窄患者，在CAS术前即刻、术后0.5 h、18 h和6 d的外周血中，分别检测血小板－单核细胞聚集体和纤维蛋白原受体（流式细胞术）、血小板聚集功能（比浊法）、血清可溶性CD 40配体与可溶性P-选择素（酶联免疫吸附法）的变化。患者均于术前应用了阿司匹林和氯吡格雷的双抗血小板治疗，并于术中应用了栓子保护装置。结果 可溶性CD 40配体于术后18 h、6 d与术前即刻比较均有升高，分别2.35(1.14～5.38) ng/ml、4.10(2.27～6.91) ng/ml vs 0.8(0.23～2.38) ng/ml，P<0.05。可溶性P-选择素于术后6 d与术前即刻比较也有升高（73.03±35.4 ng/ml vs 54.46±28.53 ng/ml，P<0.05）。而单核细胞－血小板聚集体、纤维蛋白原受体和血小板聚集于术后没有变化。结论 尽管在术前给予双抗血小板药物并术中应用栓子保护装置，血清可溶性CD 40配体与可溶性P-选择素的升高提示CAS后仍存在血小板激活。

    【关键词】  颈动脉； 支架； 血小板活化

    Serial Changes in Circulating Platelet Activation and Platelet Aggregation After Carotid Artery Stenting

    LIU Fang, WANG Da-ming, LIU Jia-chun, LI Jin, XU Xiao-dong, HAO Hong-jun，HUANG Yi-ning.

    (Department of Neurology, the First Hospital, Peking University, Beijing  100034, China )

    Abstract:   Objective  We investigated serial changes of circulation platelet activation markers in vivo and platelet aggregation function in vitro in patients undergoing carotid artery stenting(CAS) within 1 week.Methods  The platelet-monocyte aggregates and fibrinogen receptors analyzed by flow cytometric and platelet aggregation tests using Born’s method as well as serum soluble CD 40 ligand and soluble P-selectin quantified by enzyme-linked immunosorbent assay were determined in twenty patients with symptomatic carotid stenosis undergoing CAS. Blood samples were obtained immediately before stent implantation and 0.5 h,18 h,6 d after the procedure respectively. All twenty patients were on dual antiplatelet therapy of aspirin and clopidogrel before CAS, and all patients were stented with embolic protection devices.Results  Soluble CD 40 ligand levels increased from 0.8(0.23～2.38)ng/ml before procedure to 2.35(1.14～5.38)ng/ml,4.10(2.27～6.91)ng/ml at 18 h and 6 d after the procedure respectively （P<0.05）. Similary, soluble P-selectin levels increased from 54.46±28.53 ng/ml before procedure to 73.03±35.4 ng/ml at 6 d after the procedure（P<0.05）. Circulation platelet-monocyte aggregates,fibrinogen receptors and the maximum platelet aggregation rate, however, were not changed after the procedure.Conclusion  Elevated serum soluble CD 40 ligand and soluble P-selectin levels indicate the occurrence of platelet activation after CAS, despite treatment with dual antiplatelet therapy before CAS and the application of embolic protection devices during the procedure.

    Key words:  Carotid arteries;  Stents;  Platelet activation

    动脉粥样硬化性狭窄的颈动脉支架置入术（CAS）以其创伤小、适应范围广等特点，已逐渐成为症状性颈动脉狭窄治疗的一个新选择［1］。CAS过程中球囊扩张成形和支架置入对血管壁的创伤、局部微栓子脱落导致远端的缺血均可激活血小板。血小板聚集形成白色血栓是急性支架内血栓形成的主要机制 ［2］。研究显示联合应用阿司匹林（ASA）加氯吡格雷较单用ASA加肝素可显著降低CAS的围手术期并发症［3］。因此目前CAS术前常规给予ASA加氯吡格雷的双抗血小板治疗，并在操作前应用栓子保护装置。

    在上述措施下，CAS过程中是否还有显著的血小板激活？目前资料有限。本研究通过流式细胞术（FCM）、血小板聚集、血清中可溶性的血小板活化相关分子测定等3种方法，来观察CAS术前及术后1周内血小板激活和聚集的系列变化，以助于诠释上述问题。

    1  资料和方法

    1.1  研究对象  病例组入选标准：① 症状性高度颈动脉狭窄，经血管造影证实狭窄≥70%（采用北美症状性颈动脉内膜切除协作研究组 NASCET标准 ［4］）；② 对阿司匹林及氯吡格雷无禁忌证；③ 签署知情同意书。

    自2006年7月至2007年3月共入选患者20例，男17例，女3例，年龄43～88岁，平均68.1±11.1岁。健康对照组20例，男16例，女4例，年龄40～75岁，平均60.1±10.4岁，无心脑血管病，无肝肾功能减退及代谢性疾病，入选前1个月内未服用过影响血小板功能的药物。

    1.2  治疗方法  术前连续服用肠溶ASA 100 mg/d至少2周，氯吡格雷75 mg/d至少5 d；术中常规肝素化；术后肝素自然中和，继续服用上述双抗血小板药物至少1月。20例患者均使用了栓子保护装置（Angioguard 14例，Filterwire-EX 6例）。记录围手术期（术后30 d）内并发症的发生情况。

    1.3  血液标本采集  病例组分别于CAS支架置入前即刻、术后0.5 h、18 h和6 d取血至血清管和枸缘酸钠(106 mmol/L)抗凝管。其中CAS术前即刻、术后0.5 h经动脉鞘取血，术后18 h、6 d及健康对照组于清晨空腹经肘静脉取血。血清管立即置于4℃冰箱内1 h，而后以2 000 r/min离心10 min，取上层血清置于-80℃冰箱内待测。枸缘酸钠抗凝血立即开始FCM和血小板聚集的检测。

    1.4  检测样本的制备与测定

    1.4.1  FCM的检测  在FACScalibur流式细胞仪上测定血小板－单核细胞聚集体（PMA）和纤维蛋白原受体（即活化的血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa，用PAC-1检测）。仪器及抗体试剂均来自美国Becton-Dickinson公司。所有的抗凝血标本均于5 min内立即开始抗体标记。

    1.4.1.1  PMA检测  分别取藻红蛋白（PE）标记的CD14、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD 61各10 μl置试管中混匀为测定管；另取PE标记的鼠IgG、FITC标记的鼠IgG各10 μl置试管中混匀为对照管；两管中分别加入5 min前采集的全血100 μl与试剂轻轻混匀,室温下避光作用20 min后，每管加入2 ml FACScan 溶血素，混匀后溶血10 min，300 r/min离心5 min，PBS洗1遍，再300 r/min离心5 min，弃上清后加入2～8℃预冷的1％多聚甲醛500 μl，置2～8℃冰箱24 h内测定。首先在侧向散射光（SSC）相对于 CD 14-PE的散点图上圈定单核细胞群并设门，分析2 000个单核细胞中CD 61阳性的单核细胞的百分比，由测定管和对照管的差值代表聚集体中有血小板的单核细胞的相对含量。

    1.4.1.2  纤维蛋白原受体检测  分别取FITC标记的PAC-1和多甲藻黄素叶绿素蛋白（Percp）标记的CD 61各10 μl置试管中混匀为测定管；另取非特异性结合荧光素的IgM-FITC、CD 61-Percp各10 μl置试管中混匀为对照管，两管中分别加入5 min前采集的全血5 μl与试剂轻轻混匀,室温下避光作用20 min，加入2～8℃预冷的1％多聚甲醛500 μl，置2～8℃冰箱内2 h后，24 h内测定。以CD 61-Percp/SSC双参数设门，分析PAC-1阳性血小板的百分率，以测定管和对照管的差值代表血小板表达纤维蛋白原受体的相对含量。

    1.4.2  比浊法的血小板聚集检测  抗凝血标本于室温下先后以1 000 r/min和3 000 r/min离心各10 min，先后吸取富血小板和贫血小板血浆。分别以二磷酸腺苷（ADP，5 μmol/L）、肾上腺素（EPN，5μmol/L）、胶原（COL，2.5 μg/ml）和花生四烯酸（AA，500 μg/ml）为诱导剂，检测血小板最大聚集率（MAR）。仪器与试剂均来自美国Helena  Lab  Corp．公司。全部过程于取血后2 h内完成。

    1.4.3  血清可溶性CD 40配体（sCD 40L）和可溶性P-选择素（sP-selectin）的检测  sCD 40L（奥地利Bender MedSystem 公司）和sP-selectin（美国R&D System公司）均采用酶联免疫吸附法测定，按照试剂盒的操作说明进行。

    1.5  统计学处理  计量资料先采用One sample Kolmogorov-Smirnov正态性检验其是否符合正态分布，符合正态分布的参数以均数±标准差（x±s）表示，CAS前后系列时间的参数比较采用双因素方差分析；不符合正态分布的参数以中位数（25％，75％位数）表示，采用Friedman秩和检验。相关性分析采用Spearman秩相关分析。数据处理采用SPSS 11.0统计软件。

    2  结    果

    2.1  CAS前后FCM检测的PMA和PAC-1的变化  PMA和PAC-1在CAS术前即刻、术后0.5 h、18 h和6 d系列时间点的差异无统计学意义（P>0.05），见表1。表1  CAS前后PMA和PAC-1（中位数，25％-75％位数）的阳性百分数

    2.2  CAS前后体外4种诱导剂诱导的血小板MAR的变化  4种诱导剂诱导的血小板MAR在CAS术前即刻、术后0.5 h、18 h和6 d系列时间点的差异无统计学意义（P>0.05）。4种诱导剂的MAR在CAS前后各时间点与健康对照组比较均有降低，差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。表2  CAS前后4种诱导剂诱导的血小板MAR

    2.3  CAS前后sCD 40L和sP-selectin变化  sCD 40L在CAS术后18 h、6 d时与术前即刻和术后0.5 h比较有升高，分别2.35(1.14～5.38) ng/ml、4.10(2.27～6.91) ng/ml vs 0.8(0.23～2.38) ng/ml、0.29(0.11～0.52) ng/ml，差异有统计学意义（分别P<0.05和P<0.01）；术后0.5 h与术前即刻比较有降低，0.29(0.11～0.52) ng/ml vs 0.8(0.23～2.38) ng/ml，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

    2.4  sP-selectin与sCD 40L之间的相关性  CAS前后各时间点总的sP-selectin与sCD 40L之间呈正相关（r=0.22，P<0.001）。见图3。

    图3  CAS前后sP-selectin与sCD 40L之间的相关散点图。

    r=0.22,P<0.001。

    2.5  围手术期并发症  1例右颈内动脉眼段支架置入的患者，术后20 h出现左下肢无力，复查造影无变化，但提示椎－基底动脉系统末端血流缓慢，考虑可能与术后血压控制偏低有关（100～110/35～46 mmHg），予肝素抗凝并提高血压（140～165/50～80 mmHg）后1 h症状消失。1例左颈总/颈内动脉起始部支架置入的患者，10年前有膀胱癌手术史，术后1周出现血尿，复查示膀胱癌复发，予对症处理2日后血尿消失。其余患者于术中及术后30 d内均无脑缺血事件发生,无出血性卒中及胃肠道出血。

    3  讨    论

    血小板是经皮介入反应的关键性介质。介入致动脉内膜创伤、内皮下胶原和血小板黏附蛋白的暴露，触发血小板血栓形成来填封损伤的部位，这种血栓可扩展导致血管的阻塞 ［1］。Jeong等［2］在猪支架模型中发现，血小板聚集形成白色血栓是急性支架血栓形成的主要机制。除了在球囊扩张和支架置入的部位存在显著的血小板激活外，局部脱落的微栓子也可导致远端微循环的缺血和血小板激活［5］。血小板激活后产生释放和聚集反应，具有促栓和促炎作用。

    血小板被激活后P-selectin可自α颗粒中释放，通过P-selectin，血小板可与白细胞（尤其是中性粒细胞和单核细胞）上持续表达的P-selectin糖蛋白配体1（PSGL-1）结合而黏附于白细胞上形成的聚集体，即血小板－粒细胞聚集体和血小板－单核细胞聚集体（PMA）［6］。FCM上检测血小板膜表面的P-selectin或血小板－白细胞聚集体均可以反映血小板的活化水平。Michelson等［6］研究发现，FCM测定的循环PMA阳性率于经皮冠脉介入术（PCI）后数小时内可有升高，而血小板－中性粒细胞聚集体和血小板表面的P-selectin表达变化不明显。因此认为PMA聚集体是评价体内血小板活化更灵敏的标志物。PMA可以调整单核细胞的许多行为，如诱导单核细胞表达组织因子，促进在血管损伤部位的血栓内部纤维蛋白的沉积等［7］，在支架后血管壁损伤的炎症反应中有重要作用［8］。此外，血小板膜上的P-selectin可以迅速自血小板表面清除，进入循环形成可溶性的sP-selectin［9］，部分学者认为循环中的sP-selectin在反映体内血小板活化上也是较血小板表面P-selectin更合适的指标［10］。因此本研究采用PMA和sP-selectin来反映与P-selectin释放相关的血小板活化。

    CD 40L是另一种自血小板α颗粒释放的跨膜蛋白，通过与淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞上的CD 40受体的相互作用，可产生一系列的炎症反应，参与了动脉粥样硬化斑块内主要细胞成分的炎症反应调节［11］。血小板被激活后，CD 40L表达在其表面，随后很快被剪切下来流入血液，产生一个可溶性、三聚态的、仍然具有完全生物学活性的片断，称为可溶性CD 40L（sCD 40L），循环中95％的sCD 40L源自血小板［11］。血小板表面的CD 40L及循环中的sCD 40L都可以通过其赖－精－谷氨酸（KGD）肽的整合素识别序列与血小板膜GP Ⅱb/Ⅲa受体结合，从而稳定血小板－血小板之间的聚集［12］。

    另外血小板被激活后，其膜表面的GP Ⅱb/Ⅲa受体构型改变而活化，与纤维蛋白原结合，是多种诱导剂刺激后血小板发生聚集反应的共同通路。在FCM上，PAC-1可识别血小板膜活化的GP Ⅱb/Ⅲa（即纤维蛋白原受体），但不与静止的血小板结合，是反映体内血小板活化重要的分子标志［13］。血小板聚集试验是最常用的体外血小板功能测试，既往有报道可检测血小板的高反应性［14］，在服用抗血小板药物情况下可反映血小板尚存的聚集能力。

    本研究发现，CAS后PMA和PAC-1与支架前比较无明显变化，术后0.5 h的PMA较术前有升高趋势但未达统计学意义。FCM上指标变化不明显可能的原因有：(1)本研究中CAS均为择期手术，术前已提前应用了ASA和氯吡格雷双抗血小板治疗，并已基本达稳态。早期Gawaz等［15］的研究发现PCI后仅用阿司匹林和肝素时，激活的纤维蛋白原受体在术后1～5日内是升高的，而在同时应用噻氯匹定的患者中没有变化。Furman 等［16］研究发现PCI前已经服用ASA和氯吡格雷数日的患者，于PCI后18～24 h内循环PMA保持在基线水平。而在Michelson等［6］的发现PCI后PMA升高的研究中并未予以具体用药情况的说明。(2)本研究中所有患者均应用了栓子保护装置。在术前同样已经应用双重抗血小板药情况下，KOPP等［5］发现在CAS中术后1 d时应用保护装置组的PMA显著低于未用保护装置组，伴有围手术期缺血事件的显著减少。提示对微栓子的捕获进一步减少了血小板激活。(3)本研究取血部位均来自外周，而非局部循环的取血。在术前提前应用ASA和噻氯匹定下，Inoue等［8］的研究发现,在PCI患者的冠状窦中取血可见到P-selectin于术后15 min开始升高并持续48 h，而外周血中没有明显变化；并提出如果测定血小板-白细胞聚集体还能够提供更多局部炎症的信息。(4)如果循环活化血小板被快速的清除或黏附到血管壁上，则FCM很难检测到活化血小板的证据，而测定血浆中血小板活化的释放产物却可提示有显著的血小板激活［17］。上述因素可能是本研究中FCM检测的PMA和纤维蛋白原受体的升高变化不明显的原因，同时提示在应用双抗血小板药物和栓子保护装置下，CAS中血小板激活可能已有了部分程度的控制。

    根据作用机理，ASA主要抑制AA诱导的聚集，部分抑制COL诱导的聚集；氯吡格雷主要抑制ADP诱导的聚集；二者合用时有协同作用。本研究发现CAS组对ADP、AA和COL等诱导的聚集均有显著抑制，与临床上同时服用ASA和氯吡格雷相一致，说明血小板聚集试验在反映抗血小板药物作用上较敏感。但CAS前后聚集率的差异无显著性，提示血小板聚集试验只能间接地反映体内血小板尚存的聚集能力，而在反映体内血小板活化上不够敏感［8］。

    本研究发现，sCD 40L在CAS后0.5 h有短暂降低，而在18 h和6 d有显著升高，研究结果与Quinn等［18］以同样的取血方法在PCI中的观察结果类似，提示尽管有双重抗血小板药物，支架置入后仍存在血小板激活现象。Furman 等［16］研究发现PCI前已经服用ASA和氯吡格雷的患者，于PCI后18～24 h内没有发现血浆sCD 40L的增加。本研究与其结果不一致的原因可能与检测标本不同有关。sCD 40L在血清中的测定值多高于血浆，可能与血清中同时还有血小板微粒结合的CD 40L有关［19］，而研究认为微粒结合的CD 40L同样具有促血栓和炎症的生物学活性［20］。本研究采用采血后立即低温1 h再离心分离血清的方法，Ahn等［19］发现采用低温1h后离心的血清和用血浆的测定都减少了体外sCD 40L的释放，较常温放置后离心的血清都更好的反映了体内的sCD 40L的水平。

    sP-selectin于CAS后6 d的升高也有统计学意义，并且sP-selectin与sCD 40L之间呈正相关，可能与二者均源于血小板的α颗粒有关，与文献一致［21］。但二者来源稍有不同，sP-selectin还有部分来自内皮细胞的Weibel-Palade小体，因此sP-selectin的变化中可能还有内皮细胞激活的作用［10］。

    血清sCD 40L和sP-selectin在CAS术后1周内有升高，提示CAS后仍存在血小板激活现象，但是否需要进一步的干预还有待研究（临床观察围手术期脑缺血事件较少见）。文献报道在已提前应用ASA和氯吡格雷的情况下，CAS术中再予以GP Ⅱb/Ⅲa抑制剂，还可以使术后24h的PMA和sCD 40L进一步降低［8］；但在CAS术中加用GP Ⅱb/Ⅲa抑制剂后围手术期并发症反而增加（包括致死性颅内出血）［22］。因此CAS中，在术前ASA和氯吡格雷双抗血小板治疗和术中栓子保护装置的应用下，是否需要更强的血小板抑制还有待于进一步的临床研究。

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