利用全血凝固时间测定组织因子活性的研究

作者：齐金海，陶智，魏文宁    作者单位：1.武汉市新洲区人民医院检验科，新州 430400，2.华中科技大学同济医学院附属协和医院，武汉 430022        【摘要】  目的 应用内毒素（LPS）刺激后全血复钙时间检测全血中细胞组织因子（TF）的促凝血活性（TFPCA），并探讨其影响因素及临床意义。方法 用LPS刺激的全血复钙时间检测全血TF活性（tissue factor clotting time，TiFaCT），即在抗凝全血中加入或不加LPS于37℃温育一定时间，然后复钙检查全血凝固时间，根据全血凝固时间缩短的程度(△s)来判断TFPCA的强弱。结果 实验显示，LPS刺激全血中TFPCA能为TF途径抑制物（TFPI）部分抑制。组织凝血活酶浓度凝固时间反应曲线显示良好的相关性(r=0.916，P＝0.029),表明该试验有较高的敏感性和特异性。LPS刺激最适浓度为5.0～10 μg/ml,最佳刺激时间为4 h。初步临床应用显示正常组试验管(LPS刺激)和对照管全血复钙时间差值为30.4±25.1 △s，弥散性血管内凝血（DIC）病例组差值为95.2±68.86△s,差异有极显著意义（P<0.001）。结论 本实验研究示方法简单、适用，并有较高的特异性和敏感性,能为血栓性疾病的早期诊断提供信息。

       【关键词】  组织因子； 全血凝固时间； 血栓形成

       Study on the Determination of Tissue Factor Activity with  Whole Blood Clotting Time

       QI Jinhai, TAO Zhi, WEI Wenning (Dpartment of Clinical Laboratory Xinzhou People’s Hospital,Xinzhou， 430400, China)

       Abstract： Objective  To observe the change of whole blood recalcification time after endotoxin stimulating and detect the effect factors of procoagulant activity of tissue factor (TFPCA) of whole blood cells and its clinical significance. Methods  Using whole blood recalcification time stimulated by endotoxin to detect the activity of blood at 37℃ for a certain time period tissue factor clotting time (TiFaCT). Incubate the anticoagulant whole by adding LPS or not, detect the coagulation time of whole blood after alcificating, determine the level of TFPCA according to the abbreviated time (△s). Results  The study indicates that the TFPCA of whole blood stimulated by LPS could be partially inhibited by tissue factor pathway inhibitor (TFPI). the response curve of the thromboplastin concentrationclotting time of brain tissue presents a favorable correlation (r=0.916,P=0.029), which indicates that the test has a higher sensitivity and specificity ,the optimal LPS stimulating concentration and time is 5.0～10 μg /ml and 4 h, respectively. Primary clinical application shows that the difference of the whole blood clotting time between normal group is 30.4±25.1 △s and that of the DIC cases group is 95.2±68.8 △s with very significant difference(P<0.001). Conclusion  The abovementioned study indicates that the method presents simplicity, applicability, higher specificity and sensitivity, and can provide valuable information for the early diagnosis of thrombotic diseases.

       Key words：  Tissue factor; Whole blood cltting time; Thrombosis

       组织因子（TF）是一跨膜糖蛋白，是凝血因子Ⅶ（FⅦ）与活化Ⅶ的辅因子，TFⅦ通过水解FⅨ、Ⅹ导致凝血酶形成始动内、外凝血系统为血栓形成的关键因素。近年来研究证实，组织细胞TF在生理性止血和血管内血栓形成的启动期作用较为显著，而血流中单核细胞表达的TF则主要与持续病理剌激下血栓的增大有关［1］。组织损伤、感染、内毒素血症及肿瘤等病理情况下，血细胞TF异常表达并释放出TF微粒和可溶性TF，在血栓表面不断补充TF促进了血栓的增大。嗜酸性粒细胞和白血病细胞高表达TF蛋白而与相关疾病如心脑血管血栓形成、弥散性血管内凝血（DIC）等高凝状态的发生相关。TF促凝血活性（TFPCA）增强提示了血栓或前血栓状态的形成。因此，采用简单、特异性检测血循环中TFPCA有至关重要的意义。本资料对Saulius[2]用内毒素刺激的全血复钙时间检测全血中TF活性（tissue factor clotting time，TiFaCT）的方法，进行了研究。

       1  资料与方法

       1.1  研究对象

       1.1.1  体检健康自愿者、临床受检患者枸橼酸钠抗凝全血、血浆为主要试验材料。

       1.1.2  正常组  体检健康自愿献血者38例，男25例，女13例，年龄22～28岁，中位年龄24.4岁，检查前未服任何药物。

       1.1.3  患病组  受检病例为同济医学院附属协和医院住院急性粒细胞白血病（AML）患者64例，男42例，女22例，年龄11～76岁，中位年龄32.4岁，所有病例DIC诊断符合全国第七届血栓止血会议制定诊断标准[3]。

       1.2  设备与试剂  BOCA半自动血凝仪（中泰公司制造）、日本Sysmex CA7000全自动血凝仪、Centrifuge5810R低温离心机（德国Eppendorf公司产品）。主要试剂：内毒素（Lipopolysaccharides,LPS，Sigma），TF途径抑制物（TFPI，由ADI公司提供）、脑组织凝血活酶（自制）、凝血相关检测试剂盒（Dade Behring公司制品）。

       1.3  实验方法

       1.3.1  全血组织因子促凝活性（TFPCA）测定（TiFaCT法）  取人静脉枸缘酸抗凝全血（血∶抗凝剂，9∶1）4 ml,两支塑料试管中分别注入2 ml全血，并分别加入LPS（终浓度为10 μg/ml全血，试验管）或咪唑缓冲液（对照管），同时加入0.1 M氯化钙溶液40μl，在BOCA半自动血凝仪上测定全血凝固时间（初始凝固时间）。两试管中剩余血液同时放置37℃水浴，分别于不同温育时间同上平行测定凝血时间。所有试验重复测定2次取均值。试验管和对照管全血凝固时间差值取均值，结果以TFPCA△s或以凝血缩短时间表示。

       1.3.2  单个核细胞分离  取静脉血3 ml以109 mmol/L枸橼酸钠抗凝，3 500 r/min离心6 min,取白细胞层，用PBS缓冲液稀释20倍，小心加入装有淋巴细胞分离液3 ml的两只塑料试管中（保持细胞稀释液与分离液界面清晰），以3 500 r/min离心8 min,吸取白细胞层，2 000 r/min离心6 min,倾净并用滤纸吸去上清液，细胞沉淀用PBS（含1％牛血清白蛋白）洗涤3次备用。凝血相关检测：aPTT、纤维蛋白原（Fbg）、D二聚体（DD），方法同文献报道[3]。

       1.4  实验资料处理  应用SPSS 13.0软件进行t检验，成对t检验及两变量相关性处理。P<0.05差异有显著意义。

       2  结    果

       2.1  TFPCA实验的特异性和敏感性

       2.1.1  TFPCA浓度反应曲线  取丙酮处理脑浸出液，调整其使正常血浆在12.0±0.5 s凝固，定其TF活性单位为100％。将此TF溶液做1∶16～512，（相当TFPCA 6.25％～0.39％）倍稀释，分别加入抗凝全血并加入0.1M氯化钙溶液，记录凝固时间。半对数直线回归显示，不同TFPCA与空白对照管复钙时间的差值有良好的相关性（r=0.916，P＝0.029）。见图1。

       图1  TFPCA浓度反应曲线（n=3）

       2.1.2  全血中TFPCA抑制实验  取抗凝全血试管2只加入LPS，同时1只加入TFPI（5 ng/ml），另1只加入缓冲液，37℃水浴温育4 h同上测定凝血时间，结果显示（n＝5）未加TFPI管凝固缩短时间（△s）为80.6±34.1 s，加TFPI管为59.1±32.4 s，2组差异有显著意义（t=5.244,P<0.05），提示全血中TFPCA部分被抑制。

       2.2  TFPCA实验的影响因素

       2.2.1  单个核细胞数与TFPCA测定  将上述提取细胞用PPP分别调整至0.5、1.0、1.5、2.0、3.0×109/L，加入10 μg/ml LPS,37℃于60～360 min分别进行测定。结果见表1。表1  不同细胞数(×109)不同时段(min)血浆复钙缩短的时间*表示与加入LPS即刻与各温预时间，血浆复钙时间的差。 表1显示，用同浓度LPS（10 μg/ml）刺激细胞数在1.5～2.0×109/L时促凝作用无明显差异，4 h时反应血浆复钙缩短最明显，6 h时减弱。以下实验取1.5～2.0×109/L细胞数段可作为实验细胞数浓度。

       2.2.2  LPS浓度与血浆凝固时间的变化  在1.5～2.0×109/L血浆细胞悬液中加入1.0、5.0、10、20 μg/ml的LPS。结果见表2。表2  不同浓度LPS刺激之单个核细胞血浆凝固时间的变化表2显示LPS浓度为5.0～20 μg/ml时刺激作用相似，（P>0.05），以下实验取10 μg/ml浓度。

       2.2.3  最佳温育时间的观察结果见图2。

       2.2.4  PRP、PPP检测结果实验在150～200×109/LPRP、PPP基质血浆中加入刺激后细胞进行血浆复钙时间对比实验,以未加细胞PPP作对照。结果见图3。

       2.2.5  LPAS刺激后单个核细胞促乏因血浆复钙时间检测  TF主要是通过激活FⅦ形成TF/FⅦa复合物，并激活FⅨ随后激活FⅩ启动内外源凝血途径。用乏因子血浆代替上述正常人混合血浆，进行实验。结果见图4。

       图4显示乏FⅧ、Ⅸ血浆在刺激后细胞的作用下血浆复钙时间有相同的缩短变化趋势，而乏FⅦ、FⅩ血浆在刺激后细胞的作用下凝血时间均无明显缩短。以上结果提示细胞TF促凝作用不受内源途径凝血因子缺乏的影响，而外源凝血因子FⅦ、FⅩ的缺乏，使TF失去了作用底物所以没有TFPCA作用，同时说明了该实验的特异性。依据目前的凝血理论TF/FⅦa复合物可激活FⅨ而促进内凝血途径，但本组实验乏FⅨ血浆实验并未显示对TFPCA的影响，这可能提示TF对FⅨ激活有更为复杂的机理。

       2.2.6  重复性实验  38份正常人和67份受检病例重复性实验结果变异系数％（CV％）为8.23±3.98％。

       2.2.7  初步临床应用结果  见表3。t检验显示正常人组与疑似DIC、DIC组TFPCA△s比较差异有极显著差异（P<0.001）。两患病组组间差异无显著意义（P<0.05）。各受检组TFPCA△s异常判断标准以超出正常人组±1s为界值。结果显示正常组异常率为10.5％，疑似DIC、DIC组分别为58.3％、60.9％。表3  各组TFPCA△s及相关凝血功能测定结果

       3  讨    论

       血循环中TF的活性在血栓前状态和血栓病的发生和发展起着至关重要的作用，由于在血管损伤前血液中的炎性因子或细胞毒因子可导致血循环中白细胞特别是单核细胞TF表达增高，血浆中TF活性增强，是血栓形成的重要危险因素。因此，本文对TFPCA的检测和临床意义进行较深入的研究。

       3.1  组织因子检测的进展  对于TF抗原及TFPCA的实验室检测有许多方法，这些方法存在的问题是操作烦杂耗时、试剂昂贵不能适应临床需要，而且还会因未经刺激解密的细胞TF，而难以测得真实结果。20世纪初Richard[4]首次报道应用LPS刺激全血后的TiFaCT法测定TFPCA，并认为正常人全血中TFPCA应低于20 fM。Claudia等[5]对正常人体内实验研究表明，注射2 ng/kg LPS后，正常人全血凝固时间平均缩短23％，同时血浆中凝血酶原片段1+2(F1+2)较基础水平增高10倍。另一组临床检测数据显示，全血经LPS刺激4 h后TiFaCT平均缩短37.9％，血浆复钙时间平均缩短27.2％。本组资料正常人LPS刺激4 h后全血凝块时间平均缩短23.9％，DIC组23例平均缩短42.7％。TFPI抑制试验显示PLS刺激后缩短的全血凝块时间被部分抑制，提示了该实验的特异性。

       3.2  TFPCA测定的影响因素  本实验研究了全血中血细胞数量、LPS的浓度、刺激时间对TFPCA的检测的影响以及试验的重复性，并提供了较理想的实验数据。本资料还提供了采用PRP、PPP检测TFPCA的差异，并认为血小板对TFPCA有明显增强作用。目前诸多报道显示在血小板上并未能检出TF mRNA，推测血小板携带的TF来自其他细胞并由此影响全血中TFPCA。本组实验显示含LPS刺激后的单个核细胞在PRP中的促凝反应较PPP强。乏因子血浆TFPCA检测结果提示内源凝血途径缺乏对试验无明显影响，而外源途径凝血因子FⅦ、FⅩ对实验则有明显影响，因为TF与FⅦ形成TFFⅦa才具有促凝作用，而FⅩ则是复合物的作用底物，因此FⅦ、FⅩ缺乏血浆无法检测出TFPCA。

       3.3  临床检测结果  诸多研究表明，患者血中粒细胞表面组织因子的高表达也是体内凝血激活、血栓前状态的重要发生机理。对细胞TF的研究证实,在病理状态下,LPS、细胞因子等均可诱导单核细胞表达TF，特别是LPS可诱导单核细胞高表达TF已被广泛证实，并有明显的促凝活性[6]。存在于循环中的肿瘤细胞可高表达TF，并产生持续的TFPCA。有学者[3]用TiFaCT法测得不稳定型心绞痛患者全血中TFPCA显著高于正常人全血。笔者检查资料显示DIC和疑似DIC组TiFaCT明显较正常组短，表明两病例组全血中白血病细胞TF表达增高，TFPCA增强。由此可见TiFaCT检查结合临床症状对于诊断DIC或前DIC（preDIC）具有重要参考价值。

       【参考文献】       [1] ENGELMANN B, LUTHER T, MULLER I. Intravascular tissue factor pathwaya model for rapid initiation of coagulation within the blood vessel[J].2003,89(1):38.

       [2] SAULIUS B, BETH A. BOUCHARD,et al. Tissue factor activity in whole blood [J]. Blood,2005,105,(7):27642770.

       [3] 王学锋,王鸿利.血栓与止血的检测及应用[M].上海:世界图书出版公司，2002：376380.

       [4] RICHARDA. SANTUCCIL, JONATHAN ERLICHL, JOANNE LABRIOLAL,et al. Measurement of Tissue Factor Activity in Whole Blood[J].Thromb Haemost,2000,83:445454.

       [5] CLAUDIA M, PETER Q, NIGEL M, et al. Validation of a novel tissue factor assay in experimental human endotoxemia[J]. Thrombosis Research,2003,111:311315.

       [6] 饶绘，魏文宁.血细胞组织因子的研究进展[J].血栓与止血学,2007,13(5):232234.