血管紧张素Ⅱ对新生大鼠脑星形胶质细胞组织因子表达的影响△

作者：何美霞，傅蔓华，华海婴，叶启霞，戈士文，朱建立，李月白，贺石林    作者单位：1.郑州大学、医药科学研究院、河南省医药科学研究院，郑州 450052，2.河南省中医药研究院，郑州 450004，3.郑州大学、基础医学院，生物化学与分子生物学教研室，郑州 450052，4.中南大学、湘雅医学院，生理学系，止血生理研究室，长沙 410078     【摘要】  目的 观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对新生大鼠脑星形胶质细胞组织因子（TF）表达的影响及机制。方法 培养Wistar新生大鼠脑星形胶质细胞。细胞促凝活性（PCA）的检测采用一期凝固法；细胞TF抗原测定采用ELISA法。结果 AngⅡ(10-9～10-7M)可剂量依赖性诱导新生大鼠脑星形胶质细胞PCA、TF抗原的增加，并有明显的时效关系。洛沙坦(losartan)浓度在10-6～10-5M可不同程度地阻断AngⅡ的作用。结论 AngⅡ可诱导新生大鼠脑星形胶质细胞组织因子的表达,该作用是通过血管紧张素Ⅱ1型受体实现的。

    【关键词】  星形胶质细胞； 血管紧张素Ⅱ； 组织因子

     Effect of  Angiotensin Ⅱ on Tissue Factor Expression in Rat Astrocytes

    HE Meixia, HUA Haiying, YE Qixia, GE Shiwen, ZHU Jianli, LI Yueba,HE Shilin.

    (Henan Academy of Medical and Pharmaceutical Sciencse,Zhengzhou 450052, China)

    Abstract： Objective  To elucidate whether  angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ) induced astrocytes to express tissue factor (TF).  Methods  Astrocytes were isolated from  neonatal Wistar rats. Procoagulant activity (PCA) was determined with onestage clotting method. TF antigen was assayed by ELISA.  Results  AngⅡ(109～107M) induced significantly astrocytes to increase  PCA，TF antigen in a dose and time dependent manner; Losartan (106～105M) significantly inhibited the stimulative effects of Ang Ⅱon TF activity, antigen, and the dosedependent effects was observed. Conclusion  The present data suggested that Ang Ⅱ could  induce the expression of TF in rat astrocytes, and this effect was mediated by AT1R.

    Key words：  Astrocytes; AngiotensinⅡ; Tissue factor

    组织因子（TF）作为凝血的启动因子,体内TF的水平决定凝血过程是否启动和启动的程度［1］。并在脑缺血损伤中发挥重要作用［2］。新近有报道血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）可诱导血管内皮细胞TF的表达［3］，我们的研究也发现AngⅡ可诱导单核细胞表达TF［4］，说明AngⅡ有潜在的促栓作用。星形胶质细胞是脑中数量最多的细胞,它支持和营养神经元,而且对神经元生存所处的微环境的稳定也发挥着重要作用。业已证实星形胶质细胞在各种有害刺激下,可表达和分泌多种生物活性物质,后者可影响神经元的功能和结构。本实验开展了AngⅡ对星形胶质细胞TF表达的初步研究。

    1  材料与方法

    1.1  试剂和药品  AngⅡ、胰蛋白酶、单克隆小鼠抗大鼠神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP) 抗体为美国Chemicon公司产品。EnVision+TM山羊抗小鼠/兔二抗试剂盒、低染色背景抗体稀释液以及3,3’diaminobenzidine tetrahydrochloride（DAB）为丹麦DAKO公司产品。DMEM培养基为美国GIBCO公司产品。TF单抗(T59SB7)由Morrissey JH惠赠。洛沙坦（Losartan）由Merck公司赠送。TF ELISA试剂盒为美国ADI公司产品。

    1.2  细胞培养及鉴定  取出生2 d的Wistar乳鼠,参照文献的方法建立大鼠星形胶质细胞原代培养。细胞培养条件为饱和湿度,37℃恒温、5%CO2。将已纯化的4～8次传代用于实验,随机取一瓶弃上清,用0.01 mol/L PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定30 min,0.01 mol/L PBS清洗3次,3%H2O2于37℃作用25 min,0.01 mol/L PBS清洗3次。滴加一抗GFAP（1∶500，以抗体稀释液稀释），4℃湿盒孵育过夜，0.01 mol/L PBS洗3次。滴加EnVision+TM山羊抗小鼠/兔二抗，室温孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗3次。DAB显色，在显微镜下观察以控制显色时间，0.01 mol/L PBS漂洗中止显色。将染色细胞于明视野和相差显微镜下观察,随机选取视野(0.1 mm2)计算阳性细胞百分率,测定细胞纯度。

    1.3  实验方法  将同源传代的星形胶质细胞接种于25 ml的培养瓶中,每瓶接种细胞数为2×105个,培养细胞融合成片后,去培养基,用Dhank'S液洗3遍,然后按分组加入含有不同浓度AngⅡ或含洛沙坦的完全培养基1 ml,以完全培养基为空白对照, 37℃、5%CO2饱和湿度培养培养相应的时间后,制备细胞冻融液,贮存于-80℃待测。

    1.4  细胞冻融液促凝活性（PCA）的检测  采用一期凝固法。为确定胶质细胞冻融液的促凝活性来自TF，从以下两个方面加以证实：一是以乏FⅦ血浆代替正常人混合血浆；二是在细胞冻融液中洛沙坦。

    1.5  统计学分析  所有实验数据以均数士标准差表示。结果采用SPSS 11.0软件包进行分析。不同组间均数采用方差分析。量效关系进行相关与回归分析。P<0.05示差别有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  星形胶质细胞鉴定  星形胶质细胞能特异性分泌GFAP,故应用GFAP抗体进行鉴定,结果发现95%以上的细胞为GFAP免疫阳性细胞，呈现典型的星形胶质细胞形态：胞体小而圆，从胞体发出许多瘦而长的突起。表明培养的细胞大多数属于星形胶质细胞。

    2.2  TF活性确认  正常人混合血浆可观察到AngⅡ可诱导星形胶质细胞的PCA增加，但以乏FⅦ血浆代替正常人混合血浆，该作用消失。在细胞冻融液中加入不同浓度TF单抗作用30 min，然后测定PCA，发现促凝活性随TF单抗浓度的增加而减少，直至其促凝活性被完全对抗（表1,2），这分别从生物活性和免疫学的角度证明PCA来自于TF。表1  AngⅡ诱导星形胶质细胞促凝活性（PCA）的特性鉴定n=6,*P<0.05,**P<0.01,与对照组相比较表2  TF单抗对AngⅡ诱导星形胶质细胞促凝活性的影响

    2.3  AngⅡ对星形胶质细胞表达TF的量效关系  将细胞浓度调整在2×105/ml,加入AngⅡ（10-9M～10-7M）作用6 h后，测PCA，结果发现不同剂量AngⅡ(10-9～10-7M)处理星形胶质细胞6 h后，PCA分别增加40.4%、75.0%、91.9%。与正常对照组相比，星形胶质细胞TF抗原水平也显著增加。见表3。表3  不同浓度AngⅡ诱导星形胶质细胞TF表达

    2.4  洛沙坦对AngⅡ诱导星形胶质细胞表达TF的作用  不同剂量的洛沙坦（10-6～10-5M）处理星形胶质细胞15 min后，再加入AngⅡ作用6 h，观察其对TF抗原和活性的影响。结果发现，洛沙坦可明显减弱AngⅡ（10～7M）诱导的星形胶质细胞活性和抗原的增加（P<0.01）。见表4。表4  洛沙坦对AngⅡ诱导星形胶质细胞TF表达的影响

    3  讨    论

    大量临床与实验结果表明，在生理性止血以及病理性刺激引起的血栓形成中，TF均是凝血的启动因子。我们前期研究表明，脑缺血患者血浆TF明显增高[5],这提示患者体内外源性凝血途径可能被激活。肾素血管紧张素系统（RAS）长期以来被认为与血管运动及醛固酮的分泌有关，很少涉及血促栓作用。然而，来自临床实验和流行病学研究的证据均表明，RAS的活化可增加人类缺血性心血管疾病的危险性[6]。除循环RAS外，体内还存在着组织型RAS。用免疫组化，原位杂交等方法，己在血管壁、心脏、肾脏、肾上腺、脑等组织中发现了RAS的各种成分，且证实其来源非血源性，而是由局部组织细胞或白细胞通过自分泌或旁分泌产生的［7］。AngⅡ是RAS中最重要的生物活性多肽。脑组织中AngⅡ与脑缺血损伤的严重程度有关[8]。尽管早已知道脑组织中富含TF,但直到近10年才证实脑内的星形胶质细胞可以表达TF。以前的研究曾证明细菌脂多糖可刺激星形胶质细胞表达TF。本实验首次通过体外分离培养星形胶质细胞，应用不同浓度的AngⅡ对星形胶质细胞进行刺激，分别观察星形胶质细胞TF促凝活性和抗原含量，探讨AngⅡ对星形胶质细胞产生TF的影响，并在此基础上，应用不同浓度的洛沙坦与AngⅡ共同对星形胶质细胞进行干预，探讨洛沙坦是否抑制和阻断AngⅡ与AT1结合，降低星形胶质细胞TF的表达和活性。

    我们的实验结果提示AngⅡ可以刺激星形胶质细胞表达TF,说明当脑内病变或外伤时,在AngⅡ刺激下,局部可形成高浓度TF,有可能启动外源性凝血途径,所以星形胶质细胞具有调控止血,促进血栓形成的作用。同时我们的研究还发现该作用具有明显的量效关系。Ang受体（ATR）主要可分为两个，即AT1R与AT2R。据报道AT1R阻断剂可显著抑制血管内皮细胞和单核细胞TF的表达，而AT2R阻断剂PD123177则无此作用。另外有研究在局部脑缺血模型以及临床观察发现AT1R阻断剂可以明显改善症状以及减小梗死体积[9，10]。为了观察AngⅡ刺激星形胶质细胞表达TF的作用是否也是通过AT1R来实现的，我们选择AT1R阻断剂洛沙坦作为观察对象,结果发现它可以显著抑制TF的表达，说明AngⅡ诱导星形胶质细胞TF的表达是通过AT1R介导的。而有关AngⅡ诱导星形胶质细胞TF的表达的调控的机制尚有待今后进一步扩宽与深化的研究。

    【参考文献】[1] MACKMAN N, TILLEY RE, KEY NS. Role of the extrinsic pathway of blood coagulation in hemostasis and thrombosis［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27(8):16871693.

[2] ADAMS MJ, THOM J, HANKEY GJ, et al. The tissue factor pathway in ischemic stroke［J］.Blood Coagul Fibrinolysis，2006，17(7):527532.

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