丹参酮ⅡA对免疫性血管炎、血小板及凝血功能影响的实验研究

作者：周敏，李晓静，李晓辉，徐酉华，刘红，杨 默    作者单位：1.成都市儿童医院血液科，成都 610017，2.重庆医科大学儿童医院血液科，3.香港大学李嘉诚医学院儿童及青少年科学系     【摘要】  目的 分析丹参酮ⅡA对免疫性血管炎、血小板及凝血活性的影响，探讨其抗血小板、抗凝及降低免疫性血管炎炎症反应的机理。方法 建立免疫性血管炎模型，检测外周血小板数量、血小板聚集功能,流式细胞仪检测血小板活性标志Annexin V，ELISA法检测凝血酶原片断F1+2，HE染色、弹力纤维染色及电镜观察血管病理改变。并设立正常、模型和阿司匹林对照组。结果 免疫性血管炎急性期血小板数量异常增高，血小板聚集功能、Annexin V检测的血小板活性以及凝血酶原片断F1+2活性也有明显增高。丹参酮ⅡA治疗后，血小板数量明显降低，为931.33±254.19×109/L vs 544.00±83.88×109/L,差异有统计学意义。Annexin V检测的血小板活性以及凝血酶原片断F1+2活性也明显降低，分别为22.55±6.00% vs 12.27±6.25%、215.93±66.04 pmol/L vs 148.69±14.40 pmol/L，差异有统计学意义。与阿司匹林作用相比，除抑制血小板聚集作用稍弱外，其他作用两种药物差异均无统计学意义。结论 丹参酮ⅡA可能通过降低血小板活性及凝血活性从而降低免疫性血管炎的炎症反应，减轻血管的病理损害，达到治疗的目的

    【关键词】  血管炎； 血小板； 血液凝固； 丹参酮ⅡA

     Effects of TanshinoneⅡA on Platelets and Coagulation in Immune Vasculitis

    ZHOU Min, LI Xiaojing, LI Xiaohui, XU Youhua , YANG Mo,

    （Department of Hematology, Chengdu Children’s Hospital, Chengdu 610017, China）

    Abstract： Objective  To study the effects of tanshinone ⅡA on platelets and coagulation in immune vasculitis. Methods  The model of immune vasculitis of rabbits were reproduced by intravenous injection of bovine serum albumin twice. Periphery platelet number, platelet aggregation and the population of Annexin V in platelets were detected. Prothrombin fragment F1+2 was dectected by ILISA method. The Pathological changes of immune vasculitis were analyzed by hematoxylin and eosin staining, elastic fibers staining and electron microscopy. Results  The platelet number，platelet aggregation，the population of Annexin V and the level of prothrombin fragment F1+2 at the acute phase significantly increased in immune vasculitis model group than those in control group. Tanshinone ⅡA significantly decreased platelet number from 931.33±254.19×109/L to 544.00±83.88×109/L. The population of Annexin V and the level of prothrombin fragment F1+2 also significantly desreased from 22.55±6.00% to 12.27±6.25%,215.93±66.04 pmol/L to 148.69±14.40 pmol/L. The inhibition effect of tanshinone ⅡA was as the same as aspirin except for the inhibition to platelet aggregation. And both drugs could improve the vessels damage of immune vasculitis. Conclusions  Tanshinone ⅡA might improve the inflammation damage of vessels in immune vasculitis through the inhibition of platelets and coagulation activity.

    Key words：  Vasculitis; Platelet; Coagulation; Tanshinone ⅡA

    血管炎是一组原因不明，以非感染性炎症和坏死性血管炎为基本病理改变的结缔组织疾病，包括川崎病、过敏性紫癜等。近年研究显示，血小板除参与机体止血、凝血过程外，还具有炎性细胞的作用。血小板数量增高和异常活化理论在血管炎的发生发展及病理生理中起着重要作用。丹参酮ⅡA（tanshinoneⅡA，TanⅡA）是中药丹参的主要成分之一，其在生物体内的代谢产物参与机体的生物化学反应，表现出多种药理作用，如抑制血小板聚集、抗炎、抗菌、抗肿瘤等。本实验拟在建立免疫性血管炎动物模型的基础上，探讨免疫性血管炎是否存在血小板和凝血系统的活化，以及TanⅡA能否通过降低血小板或凝血活性从而减轻血管炎症的病理损害，达到治疗目的。并与抗血小板药阿司匹林作比较。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及主要试剂  日本大耳幼年家兔(简称幼兔)，周龄3～4周，体重800 g以下，雌雄不拘，由重庆市中药研究所提供。牛血清白蛋白购自上海华美生物工程有限公司。TanⅡA购自上海第一生化药业有限公司。阿司匹林泡腾片（商品名：巴米尔）购自阿斯利康制药有限公司。FITC标记的AnnexinV购自深圳晶美生物工程有限公司。兔凝血酶原片段F1+2 ELISA检测试剂盒试剂由武汉中美科技有限公司提供。

    1.2  动物模型的制作  参考Onouchi及韦等[1,2]方法，给予幼兔以10％牛血清白蛋白2.5 ml/kg静脉缓慢推注，正常对照组给予生理盐水2.5 ml/kg静脉缓慢推注。2周后，再次依上述方法给药，从而诱发动脉炎，形成血管炎模型。

    1.3  实验分组  ① 正常对照组（Normal），② 模型对照组（Control），③ TanⅡA治疗组（TanⅡA）：TanⅡA5 mg/kg·d1，iv，④ 阿司匹林治疗组（Aspirin）：阿司匹林泡腾片100 mg/kg·d-1（相当于人30～50 mg/kg·d-1）,灌胃，7 d后改10 mg/kg·d-1,qd（相当于人3～5 mg/kg·d-1）,至实验结束。治疗从第二剂牛血清白蛋白注射后即建模后第4天开始，至实验结束。正常及模型对照组给予生理盐水，每组12只。

    1.4  检测指标  分别于建模后，即第2次静脉注射后第7天（急性期）和第28天（恢复期）采集标本。

    1.4.1  外周血小板数量的检测  一次性微量采血管取血20 μl，专用稀释液稀释后应用全自动血细胞分析仪(Sysmex KX21，日本)进行血小板数量的检测。采血后1～3 h完成测定。

    1.4.2  血小板聚集功能的检测  心脏穿刺采血2 ml，3.8%枸橼酸钠抗凝，抗凝剂和血液的比例为1∶9。采血后立即在室温下以800 r/min×10 min离心，得到富含血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)；然后再离心3 000 r/min×15 min，得到贫血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)。调节血小板范围在100～600×109/L。采用Born氏比浊法，TYXN96智能血液凝集仪测定血小板聚集功能。血小板聚集诱导剂ADP终浓度为2 μmol/L，以记录仪自动记录聚集曲线、波型，以记录最大聚集率(maximum aggregation rate，MAR)为度，记录速度10 mm/min，平均记录5 min。上述实验操作在2 h内完成。

    聚集抑制率（％）=(对照组MAR-给药组MAR)／对照组MAR×100％。

    1.4.3  血小板活化标志Annexin V检测  取枸橼酸钠抗凝血2 ml，离心分离得富血小板血浆。PBS洗涤2次后，用1×结合缓冲液重悬细胞，并调整血小板浓度为1×106/ml。每管取血小板悬液100 μl,加入5 μl FITCAnnexin V，室温下避光孵育15 min,加入1×结合缓冲液400 μl，立即上流式细胞仪(FACSC alibur，美国Becton Dickinson公司)检测。根据前向角散射(FSC)及侧向角散射(SSC)对血小板群进行设门、分析，每份样品分析血小板1×105个。采用CELLQuest软件对结果进行分析。上述检测于2 h内完成。

    1.4.4  凝血活性的检测（凝血酶原片段F1+2）  心脏采血2 ml，立即与3.8%构椽酸钠溶液按9∶1混匀。3 000 r/min离心10 min，吸取上层淡黄色血浆，-80℃冻存，备测F1+2。采用ELISA法测定血清F1+2。测定方法严格按说明书进行。

    1.4.5  组织病理学检测  分别于造模后第7天和第28天处死各组动物，小心分离冠状动脉，一部分立即入戊二醛中固定，电镜下观察组织学变化；另一部分立即置人10%中性福尔马林中固定，常规苏木精-伊红染色及弹力纤维染色，光镜下观察组织学变化[2,3]。病理损害评分标准见表1。表1  动脉血管病理损害评分方法

    1.5  统计学分析  实验结果以均数±标准差(x±s)表示。应用SPSS 12.0统计软件分析数据，进行采用单因素方差分析或KruskalWallis秩和检验。P值<0.05具有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  血小板数量的变化  模型对照组急性期血小板数量为931.33±254.19×109/L，较正常对照组的640.67±132.22×109/L明显升高，差异有统计学意义（P＝0.004）。应用TanⅡA可以明显降低血小板数量，并且其降血小板作用和阿司匹林作用比较，无显著差异。恢复期，即病程第4周，各组之间血小板数量已无统计学差异。见表2。

    2.2  血小板聚集功能的变化  模型对照组血小板最大聚集率为38.9±13.4%，与正常对照组的20.9±8.5%比较，差异有统计学意义（P＝0.035）。阿司匹林治疗可以明显抑制血小板聚集率，抑制率为59.5%，与模型组比较，差异有统计学意义（P＝0.009）。TanⅡA治疗后血小板聚集率也有所抑制，为27.3%，但与模型组比较，无统计学差异。提示TanⅡA抑制血小板聚集作用较阿司匹林弱。病程第4周，各组之间血小板聚集率已无统计学差异。见表2。表2  血小板数量和聚集功能的改变 *P<0.05 vs正常组；**P<0.05 vs模型组。

    2.3  血小板活性指标Annexin V的改变  血管炎模型组在急性期有血小板活化，Annexin V阳性比率为22.55±6.00%,较正常对照组的6.31±1.84％明显升高，差异有统计学意义（P=0.000）。应用TanⅡA治疗后Annexin V阳性比率有明显下降，为12.27±6.25%,与模型组比较，差异有统计学意义（P=0.003）。应用阿司匹林治疗后，Annexin V阳性比率也有明显下降，为13.95±5.29%，与模型组比较，差异有统计学意义（P=0.009）。TanⅡA对血小板活化的抑制作用与阿司匹林比较，差异无统计学意义（P=0.578）。第28天检测各组Annexin V阳性比率，各组间差异无统计学意义。

    2.4  凝血活性的变化  模型组在病程第7天检测凝血酶原片断 F1+2，提示凝血活性较正常对照组有明显增高，差异有统计学意义（P=0.002），应用TanⅡA或阿司匹林均可以降低凝血活性，两者作用效果相当，无统计学差异。但在病程恢复期，各组之间凝血活性差异已无统计学意义。见表3。 表3  各实验组凝血酶原片段F1+2的改变

    2.5  各实验组不同阶段的病理改变  血管炎模型组急性期光镜下组织病理学检查结果显示：内皮细胞出现不同程度肿胀、坏死、内皮下组织水肿、血管壁炎性细胞浸润和弹力纤维断裂等改变；电镜检查可见正常血管内皮细胞呈长梭形，与血管长轴同向，平行排列，细胞间连接紧密。模型组则出现不同程度内皮细胞变形、肿胀、排列紊乱，以及脱落呈棉絮状或火山口样。弹力纤维染色显示弹力纤维有不同程度的排列紊乱和纤维断裂。恢复期病理表现为血管不同程度的纤维增生，尚未见明显的管腔狭窄。TanⅡA或阿司匹林治疗均可以明显减轻上述病理改变（1.83±0.52 or 1.92±0.66 vs 3.17±0.75,P<0．05)，差异有统计学意义。见图1，图2。

    3  讨    论

    国内外的研究显示，利用血清病原理，以日本大耳幼年白兔为实验动物，通过静脉注射牛血清白蛋白或马血清等异种蛋白[1,2]，可以形成免疫性血管炎。我们用相同的方法建立的动物模型病理结果显示：血管内皮细胞不同程度肿胀、坏死、脱落、内皮下组织水肿、血管壁炎性细胞浸润和弹力纤维断裂等改变。其中，血管炎症损害在主动脉根部、冠状动脉等部位尤为明显。其他病理改变尚包括轻度的间质性心肌炎

    图1  血管内皮细胞在电镜下的改变（×500）图2  各实验组病理改变改变，肝脏轻度空泡变性及脂肪变性、肾脏间质性炎变等，与文献[1,2]报道相符。因此模型建立成功，可作为免疫性系统性血管炎的模型。TanⅡA或阿司匹林治疗可以明显减轻了上述病理改变。

    近年来大量研究已证实，炎症和凝血之间相互联系，相互影响，炎症可以促进凝血系统激活，凝血过程中产生的活化因子反过来可以影响炎症过程[4]，炎症－凝血网络是血栓形成的基础。在免疫性血管损伤时，由于内皮细胞受损，内皮下基质如组织因子、胶原蛋白等暴露，血小板黏附、聚集，激活并释放各种炎性介质、细胞因子、黏附分子等，如二磷酸腺苷、血栓烷素A2、IL1、IL6等，从而激活凝血途径并影响炎症过程。血小板和凝血系统激活及其形成的炎症－凝血网络在免疫性血管炎等疾病的发生发展中起着重要的作用,并与心血管危险事件相关[57]。我们的研究显示：免疫性血管炎急性期有血小板数量明显增多，血小板聚集功能增加。应用TanⅡA治疗可以降低血小板数目和血小板聚集活性，并且其抑制作用与传统的抗血小板药物阿司匹林基本相当。有研究显示，TanⅡA和阿司匹林是通过不同环节影响血小板的聚集、黏附及释放功能，丹参能明显升高血浆PGI2的水平，阿司匹林则明显降低血浆TXA2水平，提示丹参的作用靶点可能在PGI2，而阿司匹林作用靶点在TXA2[8]。

    当血小板活化时，位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)翻转到细胞膜外侧面，因子Ⅸa、Ⅷa、Ⅹa和因子Ⅴa通过静电及疏水作用结合至膜PS上，在Ca2＋的参与下，形成凝血酶原酶复合物，使凝血酶原迅速转变为凝血酶。因此，血小板表面PS增加的患者，其体内的凝血酶活性增高，易发生血栓栓塞。流式检测Annexin V表达的多少即PS暴露率是测定血小板活化的主要指标之一[9]。我们的结果显示：模型组急性期由Annexin V检测的血小板活性有明显的增高，TanⅡA或阿司匹林均可以明显抑制降低血小板活化，两者作用效果相当，差异无显著性。

    F1+2是血液凝固过程中FⅩa复合物水解凝血酶原后所生成的多肽片断。F1+2在血浆中的水平，可以较灵敏地反映FⅩa的活性及凝血状态，是体内凝血活化的较灵敏的早期分子标志物[10]。我们的研究显示，免疫性血管炎急性期F1+2活性明显增高，TanⅡA或阿司匹林均可以降低F1+2活性，从而降低血管炎的血液高凝状态，减少心血管危险事件。恢复期则各组之间已无显著差异。

    综上显示，免疫性血管炎急性期存在血小板数量和活化异常，以及血液凝血活性增高。应用TanⅡA治疗可以明显降低上述各项指标，同时血管炎急性期的病理损害明显减轻，与模型组比较，差异有统计学意义。提示TanⅡA具有较强的抗炎、抗血小板作用和减轻血管炎性反应的作用。我们的研究还显示，TanⅡA抗血小板、抗凝作用及减轻炎症病理损害的疗效与阿司匹林基本相当。恢复期各实验组上述血液高凝状态的指标差异已无统计学意义，强烈提示免疫性血管炎为一自限性疾病，未经干预也可能得以恢复。但是急性期应用TanⅡA或阿司匹林等抗血小板、抗炎药物可以缓解症状，减轻血液高凝状态以及炎症病理损害，从而在一定程度上防止损害加重,并可以减少相关的血栓栓塞性疾病的发生[11]。

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