儿童急性淋巴细胞白血病TELAML1融合基因的表达水平与临床特点、早期治疗反应的关系

儿童急性淋巴细胞白血病TELAML1融合基因的表达水平与临床特点、早期治疗反应的关系作者：李志刚， 赵玮， 高超， 吴敏媛， 张永红， 石慧文， 谢静    作者单位：首都医科大学北京儿童医院血液病中心，北京 100045    【摘要】  　　为探讨儿童急性淋巴细胞白血病初诊时TELAML1融合基因表达水平与患儿的临床特点、早期治疗反应的关系，采用实时定量聚合酶链反应（RQPCR）定量检测35例患儿（包括标危20例，中危15例）初诊TELAML1表达水平和诱导缓解治疗结束微小残留病（MRD）水平，比较MRD阴性与MRD阳性患儿的初诊TELAML1表达水平及临床特点，分析初诊TELAML1表达水平、MRD水平与临床特点、早期治疗反应的相关性。 结果发现，初诊时TELAML1表达水平为1.63×104拷贝/104拷贝ABL（中位数）。诱导缓解结束时，16例（10例标危、6例中危）患儿未达到分子缓解，MRD水平分别为0.84-282.93拷贝/104拷贝ABL。初诊TELAML1表达水平与各临床特点及MRD水平缺乏相关性。MRD水平与泼尼松实验治疗第8天外周血幼稚细胞数显著相关。初诊时外周血白细胞计数＜25×109/L的患儿，MRD水平还与白细胞计数、幼稚细胞百分比显著相关。MRD阴性患儿初诊TELAML1表达水平显著低于MRD阳性者。结论： 对于TELAML1+儿童ALL，45.71%未能在诱导缓解治疗结束时获得分子缓解，说明了后续治疗的重要性。泼尼松实验治疗的效果预示了诱导缓解治疗结束时的MRD水平。初诊外周血白细胞计数、幼稚细胞百分比和初诊TELAML1表达水平均在一定程度上影响诱导缓解治疗结束时的MRD水平。    【关键词】  急性淋巴细胞白血病　实时定量PCR　TELAML1　微小残留病　　Relation between TELAML1 Expression Level and Clinical Characteristics as well as Early Response to Treatment in Children with Acute Lymphoblastic Leukemia LI ZhiGang, ZHAO Wei, GAO Zhao, WU MinYuan, ZHANG YongHong, SHI HuiWen, XIE Jing  Hematological center, Beijing Children Hospital,  Capital Medical University, Beijing 100045, China    Abstract    The study was aimed to investigate the relation between the expression level of TELAML1 (translocation ETS leukemiaacute myeloid leukemia 1) fusion gene and clinical characteristics as well as early response to treatment in children with ALL (acute lymphoblastic leukemia). With realtime quantitative polymerase chain reaction (RQPCR), the expression level of TELAML1 at diagnosis and MRD (minimal residual disease) at the end of induction of remission were detected in 35 children with ALL, including 20 SR (standard risk) and 15 IR (intermediate risk) patients. The expression level of TELAML1 and clinical characteristics at diagnosis were compared between MRD negative and MRD positive patients. The relation between TELAML1 expression levels at diagnosis, MRD level and clinical characteristics as well as early response to treatment were also explored. The results indicated that the expression levels of TELAML1 at diagnosis were 1.63×104 copies/104 copies ABL(median). At the end of induction of remission, 16 patients (10 SR and 6 IR patients) did not  achieve molecular remission, whose MRD levels were 0.84-282.93 copies/104 copies ABL. No relation was found between expression levels of TELAML1 at diagnosis and clinical characteristics as well as MRD level. There was a significant relation between MRD level and blast count in peripheral blood (PB)  at    day  8  after  prednisone trial induction. Significant relations between MRD level and presenting leukocyte count, blast percentage in PB were also found in the patients with presenting leukocyte count ＜25×109/L. TELAML1 expression level at diagnosis of MRD negative patients was lower than that of MRD positive ones. It is concluded  that therapy after induction of remission is of importance by the fact that 45.71% children with TELAML1+ ALL did  not achieve  molecular remission at the end of induction of remission. The effectiveness of prednisone trial predicts the MRD level. In addition, presenting leukocyte count, blast percentage in PB and TELAML1 expression level at diagnosis may   have an effect  on MRD    Key words    acute lymphoblastic leukemia; realtime quantitative PCR; TELAML1; minimal residual disease  J Exp Hematol 2007; 15(3):523-527    t(12;21) (p13;q22)易位是儿童急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）最常见的染色体重排。易位形成的TELAML1（translocation ETS leukemiaacute myeloid leukemia 1）融合基因已被认为是急性白血病的发病关键机制之一。虽然大多数研究认为t(12;21)/TELAML1+儿童ALL预后很好［1］，但在某些研究中仍存在复发等问题［2］，并可能与这种亚型白血病的异质性有关［3，4］。本研究采用实时定量聚合酶链反应（realtime quantitative polymerase chain reaction, RQPCR），定量检测了TELAML1的表达水平，探讨其与儿童ALL重要的预后因素——早期治疗反应的关系，并分析该亚型白血病的一些临床特点。研究对象    2004年9月-2006年4月，我院经多重PCR方法检测携带TELAML1融合基因的35例ALL初诊患儿，其中男14例，女21例。所有病例均经临床、形态学、免疫学、组织化学染色、染色体核型分析确诊。20例为标危患儿，15例为中危患儿。    根据患儿的年龄，可将其分为＜6岁组和≥6岁组。＜6岁组共26例，其中男11例，女15例，年龄1岁11个月-5岁11个月，中位年龄47.5个月；≥6岁组共9例，其中男3例，女6例，年龄6-14岁，中位年龄7岁7个月。    根据患儿初诊时外周血白细胞计数，可将其分为＜25×109/L组和≥25×109/L组。＜25×109/L组共28例，其中男13例，女15例，年龄1岁11个月-14岁，中位年龄53.5个月；≥25×109/L组共7例，其中男1例，女6例，年龄2岁11个月-12岁6个月，中位年龄45个月。    RNA提取和cDNA合成    采集患者骨髓2 ml，EDTA抗凝，经红细胞裂解液分离得到白细胞。按照TRIZOL(购自Invitrogen公司)产品说明书提取细胞总RNA。利用随机逆转录反应，将2 μg总RNA逆转录为cDNA，置于-20℃备用。    RQPCR检测    引物和探针  TELAML1融合基因和内对照ABL基因的引物和探针序列分别见参考文献［5］和［6］。引物及探针均由上海生工生物工程有限公司合成。    TELAML1和ABL基因定量标准品的制备  利用扩增获得的TELAML1和ABL基因片段，采用常规TA载体克隆方案，将其分别克隆至pBluescript SK＋质粒中，经蓝白斑LB平板筛选、含氨苄青霉素LB培养基培养、提取质粒、酶切鉴定及DNA序列分析后，将确证含有TELAML1和ABL基因片段的质粒，经纯化和线性化及紫外分光光度计检测吸光度，折算为拷贝数，用TE缓冲液进行10倍梯度稀释，配制成106-100copies/μl系列标准品，置于4℃冰箱备用。    RQPCR扩增体系  12.5  μl反应体系中，含有QPCR ROX Mix 缓冲液（购自AB基因公司）6.25   μl，上、下游引物各3.75  nmol，探针2.5  nmol，质粒标准品或患儿cDNA 1 μl（相当于80 ng总RNA）。在ABI 7000扩增仪上进行扩增，95℃预变性15分钟，95℃ 15秒，60℃ 1分钟，50个循环。根据标准品的结果自动绘制出标准曲线，患儿的结果由标准曲线读出。    RQPCR方法的敏感度  分别扩增8个浓度梯度（106-100copies/μl、5 copies/μl）的TELAML1质粒标准品，每个梯度重复检测3次。    RQPCR方法的可重复性  分别扩增5个浓度梯度（106-102copies/μl）的TELAML1及ABL质粒标准品，每个梯度重复检测3次，根据CT值计算批内变异系数；上述实验连作3天，根据CT值计算批间变异系数。比较所有检测中的标准曲线关键数据（斜率、截距、相关系数）的变异系数，进一步验证实验的可重复性。    TELAML1融合基因表达水平的检测    采用上述RQPCR方法，对所有患儿在初诊及诱导缓解治疗结束时（治疗开始后第33天）检测TELAML1和ABL的水平。每一样本的TELAML1和ABL均重复检测2次，取平均值，采用二者的比值（TELAML1/ABL）表示融合基因的水平。诱导缓解结束时TELAML1表达水平即微小残留病（minimal residual disease, MRD）水平。    治疗    确诊后，根据我院ALL03方案，分别予VDLP（长春新碱VCR、柔红酶素DNR、左旋门冬酰胺酶LAsp、泼尼松Pred）诱导缓解治疗。缓解后继续按ALL03方案治疗。所有患儿目前均处于完全缓解状态。疗效参照1987年全国白血病化学治疗讨论会制定的标准。    统计学分析    对所有患儿、＜6岁组和≥6岁组、＜25×109/L组和≥25×109/L组，采用线性回归方法，分析初诊TELAML1表达水平及诱导缓解治疗结束时MRD水平，与患儿年龄、初诊时外周血白细胞计数、外周血及骨髓幼稚细胞百分比、泼尼松实验治疗第8天外周血幼稚细胞数、诱导缓解结束骨髓幼稚细胞百分比等临床特点的相关性。采用独立样本t检验，比较MRD阴性与MRD阳性患儿的上述临床特点。所有统计学处理均采用SPSS 11.5软件包。结    果    RQPCR方法的敏感度    判断某一反应管的结果阳性的标准为：扩增曲线呈"S"型，并且CT值<（Y轴截距+1）。在此基础上，可重复敏感度定义为：重复检测3次，至少2次为阳性，且CT值的最大差距<1.5的最大稀释倍数。最大敏感度定义为：重复检测3次，至少1次为阳性的最大稀释倍数，不论CT值的大小［5,7］。    本实验中，在10 copies/μl梯度时，重复检测3次，3次呈阳性，CT值的最大差距为1.44；在5 copies/μl时，重复检测3次，1次呈阳性；在1copy/μl时，重复检测3次，均呈阴性。因此，可重复敏感度为10拷贝，最大敏感度为5拷贝。    RQPCR方法的可重复性    由表1可见，各浓度梯度TELAML1和ABL的最大批内和批间的变异系数分别为2.03%和1.03%、1.20%和2.13%，可见本方法的可重复性较好。TELAML1和ABL标准曲线关键数据（斜率、截距、相关系数）的最大变异系数分别为0.64%和0.90%，可见不同实验TELAML1和ABL标准曲线的离散程度小，可重复性好。    初诊TELAML1表达水平、诱导缓解治疗结束时MRD水平及其与临床特点的相关性    初诊时TELAML1表达水平为3.00×103-3.89×104拷贝/104拷贝ABL，平均值为1.76×104拷贝/104拷贝ABL。诱导缓解结束时，MRD水平为0-282.93拷贝/104拷贝ABL，平均值为13.43拷贝/104拷贝ABL。无论将患儿作为整体进行分析，或按照年龄、初诊时外周血白细胞计数分组后分析，初诊时TELAML1表达水平与各临床特点及MRD水平均缺乏相关性（P＞0.05）。将患儿作为整体或按照年龄、初诊时外周血白细胞计数分别进行分析，发现MRD水平都与泼尼松实验治疗第8天外周血幼稚细胞数显著相关。这提示无论年龄、外周血白细胞水平，泼尼松实验治疗的效果都预示了诱导缓解治疗结束时的MRD水平，与其它临床特点缺乏相关性。另外，白细胞计数＜25×109/L的患儿，MRD水平还与初诊时外周血白细胞计数、幼稚细胞百分比显著相关，提示对于初诊外周血白细胞计数＜25×109/L的患儿，肿瘤负荷越大（即初诊时外周血白细胞计数越高或幼稚细胞百分比越大），诱导缓解治疗结束时MRD水平越高（表2）。    诱导缓解结束时MRD阴性组和阳性组的临床特点比较    诱导缓解结束时所有患儿均达到形态学完全缓解。共有19例患儿MRD检测呈阴性，分子缓解率为54.29%（19/35），16例患儿MRD检测呈阳性，阳性率为45.7%。比较两组患儿的临床特点，发现MRD阴性患儿初诊时TELAML1表达水平显著低于MRD阳性者，其它方面均没有差异（表3）。上述结果提示初诊时TELAML1表达水平低的患儿更易于获得分子缓解讨    论    t(12;21)易位及TELAML1融合基因在儿童B前体细胞ALL中的发生率高达20%-25%，是儿童ALL最常见的染色体易位。由于t(12;21)易位很难用染色体核型分析方法检出，因此利用PCR或荧光原位杂交检测TELAML1融合基因就显得很重要了，而定量PCR检测不但能确定白血病细胞是否表达这种融合基因，而且在治疗的不同阶段，还能反映出融合基因表达水平的变化。定量PCR方法可用于评价患儿的治疗反应及定量检测微小残留病。因此，本研究采用了定量PCR方法。经检验证实，该方法敏感度高（可重复敏感度和最大敏感度分别为10拷贝和5拷贝）、离散程度小、重复性好，适于进行上述研究。    迄今为止，大多数研究认为，t(12;21)/TELAML1+儿童ALL预后很好，例如Loh等［1］最近的研究指出，TELAML1+儿童ALL的5年无事件生存率和总生存率分别为89%和97%，高于TELAML1-儿童ALL的80%和89%。但也有研究发现，t(12;21)/TELAML1+儿童ALL的预后并不比其他儿童ALL好［8］。这一方面是由于t(12;21)/TELAML1+儿童ALL是一个异质性群体，存在多种分子、细胞遗传学异常，包括正常TEL基因的丢失或低表达、AML1基因的增加与高表达、衍生21号染色体以及AML1TEL融合基因的高表达等，并且与治疗效果存在相关性［3，4］。另一方面，各个研究所采用的治疗方案、治疗强度不同也是导致这种结果的重要原因［2］。 因此，以TELAML1融合基因为标志，在特定的治疗时间点定量检测MRD水平，对于评估这些患儿的治疗反应和预后、预防复发是非常重要的。    本组35例患儿，初诊时年龄1岁11月-14岁，外周血白细胞计数（1.5-251.0）×109/L。诱导缓解治疗结束时，虽然均获得形态学完全缓解，但仍有45.71%（16/35）的患儿MRD检测呈阳性，1例患儿的MRD水平高达282.93拷贝/104拷贝ABL，其泼尼松实验治疗第8天外周血幼稚细胞数达1 992个/μl。可见本组患儿无论在初诊时的临床特点，还是在早期治疗反应等方面都存在异质性。    Stams等［3］发现，对于采用荷兰儿童肿瘤研究组(DCOG)和德国儿童ALL研究协作组(COALL)方案治疗的t(12;21)+儿童ALL，对泼尼松的体外耐受是独立的预后因素。本研究中，所有患儿的MRD水平都与泼尼松实验治疗第8天外周血幼稚细胞数显著相关，提示对于t(12;21)/TELAML1+儿童ALL，泼尼松实验治疗的效果强烈预示了患儿能否在诱导缓解结束时获得分子缓解，而尽早获得分子缓解对于患儿的长期无病生存非常重要［9］。因此，本研究也说明，对于t(12;21)/TELAML1+儿童ALL，泼尼松实验治疗的效果具有重要的预后价值。    初诊外周血白细胞计数是儿童ALL的重要预后指标，Loh等［1］认为，对于t(12;21)/TELAML1+儿童ALL，诊断时的白细胞计数仍是应予重视的预后因素。本研究发现，当初诊外周血白细胞计数＜25×109/L时，白细胞水平越高或幼稚细胞百分比越大（意味着肿瘤负荷越大），诱导缓解治疗结束时MRD水平越高。MRD阴性患儿初诊时TELAML1表达水平显著低于MRD阳性者。这说明白细胞计数、幼稚细胞百分比及初诊TELAML1表达水平等，都不同程度地影响着患儿的治疗效果。    TELAML1已广泛应用于儿童ALL微小残留病定量检测中。有研究显示，将t(12;21)/TELAML1+儿童ALL按照诱导缓解结束时的MRD水平分为阴性组和阳性组，两组在无病生存方面存在显著差异［9］。而且，以TELAML1及Ig/TCR基因重排为靶分子的MRD检测可以有效地互补［10，11］。本组35例患儿，诱导缓解结束时形态学完全缓解率为100%。但采用RQPCR技术定量检测TELAML1表达水平，发现45.71%（16/35例，标危10例，中危6例）的患儿未能达到分子缓解，MRD水平为0.84拷贝-282.93拷贝/104拷贝ABL。此结果说明本方法可以用于以TELAML1为靶分子的MRD检测。目前，对于TELAML1+儿童ALL，以拷贝数表示的MRD水平与预后的关系尚未得出明确结论。本组患儿也需要延长追踪时间，观察MRD水平与预后的相关性，以期更好地指导临床治疗。【参考文献】1Loh ML, Goldwasser MA, Silverman LB, et al. Prospective analysis of TEL/AML1positive patients treated on DanaFarber Cancer Institute Consortium Protocol 9501. Blood, 2006; 107: 4508-45132Loh ML, Rubnitz JE. TEL/AML1positive pediatric leukemia: prognostic significance and therapeutic approaches. Curr Opin Hematol, 2002; 9: 345-3523Stams WA, Beverloo HB, denBoer ML, et al. Incidence of additional genetic changes in the TEL and AML1 genes in DCOG and COALLtreated t(12;21)positive pediatric ALL, and their relation with drug sensitivity and clinical outcome. Leukemia, 2006; 20: 410-4164Stams WA, denBoer ML, Beverloo HB, et al. Expression levels of TEL, AML1, and the fusion products TELAML1 and AML1TEL versus drug sensitivity and clinical outcome in t(12;21)positive pediatric acute lymphoblastic leukemia. Clin Cancer Res, 2005; 11: 2974-29805Gabert J, Beillard E, vander Velden VH, et al. 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