姜黄素与STI571对慢性粒细胞白血病细胞株K562作用的体外研究

作者:张昆仲,许建华,黄秀旺

   【关键词】  ,姜黄素;,STI571;,白血病,髓样,慢性;,药物疗法,联合　　摘要:  目的  研究姜黄素(Cur)、STI571以及二者联合应用对慢性粒细胞白血病细胞株K562的影响,探索两药的不同效果及联合应用机制。  方法  锥虫蓝排染法计算K562细胞增殖抑制率;Western blot方法检测Cur、STI571以及二者联合应用对K562细胞P210bcr/abl蛋白含量及其下游信号蛋白激酶C(PKC)的影响;用金氏公式评价两药的协同效果。  结果  Cur和STI571联合应用对K562细胞呈剂量依赖性的抑制作用,协同指数Q值均>0.85;Western blot显示,Cur和STI571联合应用对P210bcr/abl及PKC的下调呈明显增强作用。  结论  Cur与低剂量(0.1,0.15 μmol/L)的STI571联合应用对抑制K562细胞增殖呈单独相加;而较大剂量则可明显协同下调P210bcr/abl和PKC的表达水平。

　　关键词:  姜黄素; STI571; 白血病,髓样,慢性; 药物疗法,联合

　　In Vitro Study of the Combination of Curcumin and STI571 on Chronic Myelogenous Leukemia Cell Line K562

　　Zhang Kunzhong, Xu Jianhua, Huang Xiuwang, Wu Lixian, Wen Caixia, Chen Yuanzhong

　　1.Institute of Clinical Pharmacology, School of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China

　　2.Fujian Institute of Hematology, Fuzhou 350001, China

    ABSTRACT:  Objective  To investigate the effects of the combination of curcumin(Cur) and STI571 on chronic myelogenous leukemia(CML) cell line K562.  Methods  Trypan blue exclusive staining was used to assess the inhibition of K562 cells; Western blot was used to assess the expression level of P210bcr/abl protein and PKC after treatment with Cur, STI571 or their combination; Jin's formula was used to assess the synergistic effects between Cur and STI571.  Results  Combination of Cur and STI571 exerted dosedependant effects on the inhibition of K562 cells, their combination indexes q>0.85. Western blot showed that the combination of Cur and STI571 shows exerted synergistic downregulation of P210bcr/abl protein and PKC.  Conclusion  The combination of Cur and lower doses of STI571 simple synergistic inhibition of K562 cell growth; while a comparatively large doses of STI571 and Cur synergistically reduced significantly of P210bcr/abl protein and PKC.

　　KEY WORDS:  curcumin; STI571; leukemia,myeloid,chronic; drug therapy,combination

    慢性粒细胞白血病(CML)是以费城染色体(Ph)为特征的多潜能干细胞异常的骨髓恶性增殖性疾病。Ph染色体是由9号染色体cabl癌基因易位到22号染色体的bcr基因处,形成bcr/abl融合基因,该基因经转录后,编码8.5 kb的嵌合体mRNA,目前认为>95%的CML患者含有bcr/abl融合基因,该基因翻译成相对分子质量为210 kD的蛋白质,即P210bcr/abl融合蛋白(P210bcr/abl),该蛋白具有异常活跃的酪氨酸激酶活性,并活化细胞内相关的信号转导通路从而调控细胞的分裂与增殖,与CML的发病机制密切相关,为CML的治疗提供了重要的分子靶点[12]。因此,研究药物对P210bcr/abl及其下游的信号转导通路的影响对CML的治疗具有重要的意义。

    STI571(Gleevec,CGP57148B,imatinib mesylate)是一种小分子的2苯胺嘧啶衍生物,是酪氨酸激酶抑制剂,目前临床上主要用于治疗CML。随着该药的应用,其不良反应及耐药问题相继出现,且该药价格昂贵。因此,探索一种药物来替代它或与其联合应用以期减少其用量或能够延缓、逆转其耐药的药物,成为目前研究的热点。

中药姜黄性温,味辛苦,具有破瘀行气之功效。姜黄素(Cur)系从姜黄(Curcuma Longa L.)中提取的酚性有效单体化合物,具有抗肿瘤、抗氧化、抗突变、降血脂、抗炎、抗血小板聚集等广泛的药理作用,且其价格低廉,用药安全[34]。近年来,有关Cur的药理学研究,尤其在其抑制细胞增殖、诱导癌细胞凋亡等直接的抗癌活性作用方面日益受到重视。笔者曾报道Cur对CML细胞株K562的作用,Cur对K562细胞及其耐阿霉素细胞株K562/ADM的IC50分别为4.30 μg/mL和23.05 μg/mL,并可诱导K562细胞凋亡,阻断细胞周期于S期[56]。研究表明,Cur可特异性地减少P210bcr/abl含量从而下调其激活的Ras信号途径,最终抑制K562细胞的增殖[7]。笔者进一步探讨Cur与STI571在体外进行联合作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  药品与试剂 

　　姜黄素(上海试剂三厂,批号980825),纯度99%,溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,配成20 mmol/L储存液于-20 ℃储存备用;STI571(瑞士诺华公司惠赠),经本所萃取,重结晶所得,纯度99%,溶解于DMSO中,配成10 mmol/L,于-20 ℃储存备用。Western blot所用抗体CAbl,PKC,βactin及二抗(美国Santa Cruz公司);碱磷酶底物显色剂(新加坡Gene Lab);考马斯亮蓝试剂盒(江苏南京建成生物试剂公司)。

　　1.1.2  细胞株及培养条件 

　　CML细胞株K562(中科院上海细胞研究所),培养于10%小牛血清,1×108 U/L青霉素,100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液,在37 ℃、体积分数为0.05的 CO2条件下培养。细胞接种24 h后进入指数增长期。

　　1.2  方法

　　1.2.1  Cur及STI571对K562细胞的影响 

　　取指数增长期的K562细胞100 μL[(24)×109L1],加入96孔板中,每个加药组设3个复孔,分别设空白组,Cur 10,15,20 μmol/L与STI571 0.1和0.15 μmol/L的单独与联合组,给药后各孔终体积相同。将培养板置于37 ℃,体积分数为0.05的CO2培养箱培养,48 h后用锥虫蓝排染记数。

    抑制率= [(空白组实验组)/空白组]×100%。

　　1.2.2  P210bcr/abl、蛋白激酶C(PKC)的表达 

　　取对数增长期K562细胞接种培养板中,分别加入STI571 0.2,0.4,0.8 μmol/L和/或Cur 15 μmol/L,置于37 ℃,体积分数为0.05的 CO2培养箱培养,24 h后收集细胞,并根据分子克隆实验指南[8],提取细胞蛋白,SDSPAGE电泳,转膜,封闭。分别加入抗ABL单抗、PKC单抗及βactin抗体作用2 h后,用PBS(pH 7.2)洗膜3次,再加二抗,洗去二抗后，用Western blot底物显色,拍照。印迹条带用软件分析(Band Leader Ver 3.00)。P210bcr/abl或PKC蛋白表达水平是用其相应扫描的数值与βactin数值的比值表示。

　　1.3  统计学处理 

　　数据用x±s表示,组间差异用t检验。计算两药联合应用时,用金氏公式求协同指数[910]：    q=Ea+b/(Ea+EbEa×Eb)其中Ea+b为合用抑制率,Ea和Eb分别为A药和B药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”,分母是“期望合并效应”,q是二者之比。    q=0.85~1.15为单独相加(＋),q=1.15~2.0为增强(),q>2.0为明显增强(),q<0.85~0.55为拮抗(－),q<0.55为明显拮抗()。

　　2  结  果

　　2.1  Cur和/或STI571对K562细胞增殖的影响 

　　K562细胞经不同浓度的STI571和Cur处理48 h之后,呈现不同的增殖抑制情况。单独给予STI571 0.1,0.15 μmol/L,细胞抑制率分别为56%和74%,而单独给予Cur 10,15,20 μmol/L对K562细胞的生长抑制率为35%,70%,85%,二者联合应用抑制率呈剂量依赖性增加。STI571 0.1和Cur 10,15,20 μmol/L联合后,抑制率分别为63%,82% 和94%,协同指数q值分别为0.88,0.94和1.0;STI571 0.15和Cur 10,15,20 μmol/L联合后,抑制率分别为77%,91%和97%,协同指数q值分别为0.93,0.98和1.0(图1)。

2.2  Cur和/或STI571对P210bcr/abl、PKC的影响

　　2.2.1  对P210bcr/abl的影响 

　　K562细胞经过不同福建医科大学学报  2006年9月  第40卷第5期张昆仲等：姜黄素与STI571对慢性粒细胞白血病细胞株K562作用的体外研究   

　　A:Cur+STI571对STI571抑制K562 细胞增殖的影响； B:STI571+Cur对Cur抑制K562细胞增殖的影响

　　浓度STI571和/或Cur处理24 h后,单独给予STI571 0.2,0.4,0.8 μmol/L,P210bcr/abl含量分别为4%,10%(与对照组比较，P>0.05)和20.8%(图2)。但是,在和15 μmol/L Cur(单独下降率24%)联合应用后,P210bcr/abl含量明显下降,和空白组比较,P210bcr/abl含量分别下降66%,70%和71%以上。

    A:P210bcr/ab1与βactin条带扫描比值示意图； B：Western blot印迹条带

    1:对照组; 2:STI571 0.2 μmol/L; 3:STI571 0.4 μmol/L; 4:STI571 0.8 μmol/L; 5:Cur 15 μmol/L; 6:STI571 0.2+Cur 15 μmol/L; 7:STI571 0.4+Cur 15 μmol/L; 8:STI571 0.8+Cur 15 μmol/L

    n=3.  与对照组和对应的STI571组比较,#:P<0.01; 与Cur比较,☆:P<0.01.

　　2.2.2  对P210bcr/abl下游信号PKC的影响 

　　K562细胞经过不同浓度的STI571和/或Cur处理后24 h后,Western blot结果显示,单独给予STI571 0.2,0.4,0.8 μmol/L后,PKC蛋白含量出现下调,和空白组比较分别下降14%,56%,60%,与15 μmol/L Cur(单独下调52%)联合应用后,PKC蛋白含量下降更加明显,和空白组比较,PKC蛋白含量分别下降54%,80%和78%以上(图3)。

    A：PKC与βactin条带扫描比值示意图； B：Western blot印迹条带

    1:对照组; 2:STI571 0.2 μmol/L; 3:STI571 0.4 μmol/L; 4:STI571 0.8 μmol/L; 5:Cur 15 μmol/L; 6:STI571 0.2+Cur 15 μmol/L; 7:STI571 0.4+Cur 15 μmol/L; 8:STI571 0.8+Cur 15 μmol/L

    n=3. 与对照组和对应的STI571组比较,#:P<0.01; 与Cur比较,☆:P<0.01.

　　3  讨  论

    STI571在治疗慢性粒细胞白血病方面具有独特的作用机制和高效的特异性。这是由于酪氨酸激酶催化ATP的Y磷酸基转移到蛋白质的酪氨酸残基上,而STI571是通过ATP和一含酪氨酸的底物结合而实现,竞争性抑制酶与ATP的结合来抑制激酶活性,阻断酪氨酸激酶的自身磷酸化及底物的磷酸化,彻底切断了异常的酪氨酸激酶的信号传导,从而达到抗肿瘤的目的[2,11]。但是,随着STI571的广泛应用,临床上很快出现耐STI571现象。此外,STI571也还存在其他的缺点,主要有该药对CML加速期和急变期效果不理想以及费用太高等[1213]。

    Cur的研究近年来不断受到重视,尤其在抗癌方面。福建医科大学临床药理研究所较早对Cur抗CML方面作用开展研究,证实Cur体外抑制CML的细胞K562的增殖,诱导K562细胞凋亡[57]。针对STI571在临床应用中所遇到的缺点和不足,笔者对Cur和STI571在体外联合应用进行研究，结果表明,15 μmol/L Cur和0.1,0.15 μmol/L的STI571联合应用48 h,对K562细胞呈剂量依赖性的抑制作用,其协同指数q值>0.85,表明二者呈单独相加作用。进一步研究表明,Cur与STI571联合应用对P210bcr/abl和PKC蛋白均有明显的下调作用,尤其在协同下调 P210bcr/abl时,二者的协同作用更加明显。

    通常,两药呈现协同作用往往是因为二者具有不同的作用机制。STI571是酪氨酸激酶抑制剂,其本身对P210bcr/abl并不影响[14],从本研究结果可见,STI571对P210bcr/abl并不影响,与该文献一致。但是,STI571和Cur联合应用以后,P210bcr/abl呈明显下调,达60%以上。结果表明,Cur可能通过下调P210bcr/abl含量,影响P210bcr/abl激活的下游信号通路如PKC等而产生诱导CML细胞株凋亡,抑制细胞增殖的作用。通过对P210bcr/abl下游通路PKC的研究,证实了笔者的想法。而STI571降低PKC含量则是由于不同的机制引起,STI571由于占据了ABL激酶区域的ATP口袋,阻遏ATP与ABL结合,从而抑制其激酶活性,阻断其下游信号(如PKC)转导。

 综上所述,Cur与低剂量(0.1,0.15 μmol/L)的STI571联合应用对抑制K562细胞增殖呈单独相加;而较大剂量则可明显协同下调P210bcr/abl和PKC的表达水平,其机制可能是Cur通过下调P210bcr/abl表达,进而影响其下游信号转导途径,最终发挥协同抗癌作用。

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　　基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30171158,30472187),福建省自然科学基金资助项目(C992001)

　　作者单位: 1.福建医科大学 药学院临床药理研究所,福州  350004

　　2.福建省血液病研究所,福州  350001

　　作者简介: 张昆仲(1973~),男,福建医科大学2004级博士研究生