青蒿素对人白血病U937细胞凋亡及分化的影响

作者：薄剑，王文清，王全顺，李红华，赵瑜，吴晓雄，达万明，于力    作者单位：解放军总医院血液科，北京 100853，第四军医大学西京医院血液内科， 陕西 西安 710033

【摘要】  目的： 通过青蒿素对经典人白血病细胞系U937的作用研究，探索青蒿素治疗白血病的可能. 方法： 采用细胞培养、四唑盐比色试验（MTT）、细胞形态学、DNA电泳及NBT还原试验等方法观察不同浓度青蒿素促进U937细胞凋亡及诱导分化作用. 结果： 青蒿素在浓度>6 μmol/L时可显著抑制U937细胞的增殖，促进其凋亡，并表现出剂量和时间依赖效应(P<0.01)；在诱导分化浓度下,青蒿素可促进U937细胞向成熟粒细胞分化(P<0.01). 结论： 青蒿素对白血病细胞U937的选择性促凋亡作用以及诱导分化效应表明其可能是一种理想的高效低毒抗白血病药物，有望进入临床应用.

【关键词】  青蒿素类；白血病；U937细胞；细胞增殖；细胞凋亡；细胞分化

　　Effects of artemisinin on apoptosis and differentiation of  human leukemia U937 cells

　　BO Jian, WANG WenQing, WANG QuanShun, LI HongHua,  ZHAO Yu, WU XiaoXiong, DA WanMing, YU Li

　　Department of Hematology, PLA General Hospital, Beijing  100853,  China, Department of Hematology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University,  Xian  710033,  China

　　【Abstract】  AIM: To investigate the effects of artemisinin on apoptosis and differentiation of classic human acute  monoblastic leukemia cell line U937 and to study the possibility of treatment of leukemia with artemisinin.  METHODS: The cytotoxic activity of artemisinin on U937 cells was detected by means of MTT assay. Apoptosis was identified and analyzed with transmission electron microscopy, cell cycle, and DNA gel electrophoresis. The differentiation of U937 cells into more mature granulocytes was detected by nitro blue tetrazolium (NBT) reduction test.  RESULTS: Different concentrations of artemisinin could suppress the proliferation and induced the apoptosis of U937 cells in a dose dependent (>6 μmol/L) and time dependent (1-6 d, P<0.01) manner. The data from NBT reduction test demonstrated that U937 cells  were induced to differentiate into more mature granulocytes by low dose gossypol (2-5 μmol/L, P＜0.01). CONCLUSION: Artemisinin selectively induces apoptosis of leukemia U937 cells in a smaller dose than that for human peripheral blood mononuclear cells(the control group). It suggests that artemisinin may be an ideal drug for leukemia therapy after a series of preclinlic and clinlic researches.

　　【Keywords】 artemisinins; leukemia; U937 cells;  cell proliferation;  apoptosis;  cell differentiation

　　0  引言    　　　　近年来，白血病发病率有显著升高的趋势［1］，目前，对于此类疾病的治疗仍主要采取传统的化疗手段，其显著的毒副作用使得患者的生活质量和治疗信心受到严重影响. 因此，寻找高效低毒的治疗药物，显得非常重要. 青蒿素最初以显著的抗疟原虫效应、简单易处理等作用为人们所熟知，随后进一步的研究还发现其具有广泛的生物学效应，包括抗心律失常，抑制肿瘤生长等，特别是后者，已经成为近年青蒿素研究热点之一［2］. 青蒿素对于很多实体瘤细胞，如肝癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤等细胞具有显著的杀伤作用［3-4］. 但有关青蒿素对白血病细胞的杀伤效应以及有无临床使用价值等问题的研究还少见报道. 本实验通过青蒿素对经典的白血病U937细胞系进行研究，观察其对U937细胞增殖、分化的影响，为进一步的应用研究提供理论依据.

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  正常人单个核细胞（PBMNCs）来自解放军总医院输血科正常献血离心白细胞层.  白血病细胞系、人单核细胞白血病细胞系U937细胞由本室保存. 青蒿素（Artemisinin）由广西桂林制药厂生产；RPMI 1640按说明配制. 胎牛血清 (杭州四季青生物工程材料研究所) 56℃  30 min灭活，分装，-20℃冻存备用.

　　1.2  方法

　　1.2.1  人外周血PBMNCs的制备与白血病细胞的培养［5］  将分离的白细胞层，采用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离,收集单个核细胞,经RPMI1640培养液洗涤，调整到所需细胞浓度备用. 人单核细胞白血病细胞系U937细胞以1×108/L浓度接种于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基，置37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度的培养箱中培养,每3～4 d传代1次.

　　1.2.2  试剂的制备  青蒿素用9 g/L生理盐水溶解，稀释成浓度为12.5 mmol/L的溶液，过滤除菌，分装，-20℃保存备用，用前继续稀释. 四唑氮蓝（MTT）及硝基蓝四氮唑（NBT），分别用10 mmol/L PBS配制成溶液，9 mL/L生理盐水配成为2 mL/L溶液，过滤除菌，避光4℃保存备用.

　　1.2.3  MTT法检测细胞活力  ① 检测不同浓度青蒿素对人白血病细胞系U937 细胞作用. 青蒿素浓度从100 μmol/L 开始［4］，以含同样梯度浓度生理盐水的PRMI 1640培养基为平行孔，将U937细胞以每孔4×104接种于96孔培养板中，每孔体积100 μL. 培养24 h后按倍比稀释浓度梯度加入青蒿素，继续培养. 每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，继续培养4 h，终止培养，离心吸去培养液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜震荡10 min，使结晶物充分溶解. 酶联免疫检测仪选择波长490 nm处检测A值. 以浓度为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线［6］. ② 检测不同浓度青蒿素对人外周血单个核细胞作用.  方法同上，接种密度为每孔1.5×105个细胞.

　　1.2.4  超微结构观察  将终浓度为20 μmol/L的青蒿素作用于对数生长期的U937细胞，作用24 h后收获细胞，PBS洗涤2次，转移至EP管，1500 r/min离心10～15 min. 40 mL/L戊二醛固定，送电子显微镜观察.

　　1.2.5  Annexin V检测  终浓度为20 μmol/L的青蒿素作用于对数生长期的U937细胞，12 h后收获细胞，冰冷PBS洗涤2次，细胞以105～106/L的密度重悬. Annexin VFITC和PI各5 μL加入490 μL的细胞悬液中，避光室温作用10 min，1 h内流式细胞仪检测Annexin V和PI染色.

　　1.2.6  DNA梯度电泳  按文献［7］的方法进行，终浓度为20 μmol/L的青蒿素作用于对数生长期的U937细胞，作用24 h后收获细胞，PBS洗涤2次，裂解缓冲液混匀，加入蛋白酶K 56℃消化过夜，酚氯仿抽提，冷乙醇沉淀，TE溶解. 18 g/L琼脂糖凝胶50 v电压电泳1 h，观察DNA ladder的形成情况.

　　1.2.7  WrightGiemsa染色  根据MTT实验结果，选用2, 5  μmol/L作为青蒿素诱导分化用浓度. 在含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640，4×107/L的U937细胞培养体系中，加入不同浓度的青蒿素培养5 d，将细胞离心涂片， WrightGiemsa染色，油镜下观察细胞形态.

　　1.2.8  硝基蓝四氮唑还原试验  将终浓度2和5  μmol/L青蒿素处理的U937细胞培养1～5  d. 收集细胞，以不含血清的RPMI 1460洗涤离心，弃上清，每管加入0.5 mL的1 g/L NBT溶液和0.1 mL TPA溶液，摇匀, 37℃反应30～60 min.  吸取少量细胞悬液，涂片，空气干燥，常规WrightGiemsa染色. 细胞胞质出现蓝紫色斑者为阳性. 在光学显微镜下观察200个细胞，计算阳性百分率.      　　统计学处理： 实验结果以x±s表示，组间差异采用方差分析，半数抑制浓度（IC50）采用SPSS 10.0统计软件包的概率单位法(Probit)计算.

　　2  结果

　　2.1  青蒿素对人白血病细胞系U937细胞增殖的影响  青蒿素＞6 μmol/L时，表现出对U937细胞明显的抑制增殖作用，随着时间的延长，抑制作用更加明显.  随着浓度的增加以及时间的延长,青蒿素对U937细胞的作用有明显的增殖趋势(图1).

　　图1  青蒿素对人白血病细胞系U937细胞增殖的影响（略）

　　2.2  青蒿素对PBMNCs增殖的影响  青蒿素＞12 μmol/L时，才对PBMNCs表现出明显的杀伤效应. 其对正常外周血单个核细胞的作用浓度要显著高于对白血病细胞作用浓度，提示青蒿素对白血病细胞存在非常明确的选择杀伤作用（图2）.

　　图2  青蒿素对PBMNCs增殖的影响（略）

　　2.3  电子显微镜超微结构变化  经20  μmol/L终浓度青蒿素处理24 h后的U937细胞，电镜结果可见大量的细胞表现出染色质边集等凋亡现象（图3）.

　　图3  U937细胞超微结构  ×7500（略）

　　2.4  Annexin V检测  20 μmol/L终浓度青蒿素处理24 h后U937细胞流式细胞仪检测Annexin V，结果出现显著的早期凋亡与晚期凋亡细胞群（2，4象限）（图4）.

　　A： 阴性对照细胞； B： 处理细胞.

　　图4  Annexin V检测（略）

　　2.5  梯度DNA电泳  经20 μmol/L终浓度青蒿素处理24 h 后，抽提细胞DNA电泳可见明显的DNA ladder 形成，提示青蒿素可以诱导U937细胞凋亡(图5).

　　M: 100 bp marker; 1: 20  μmol/L浓度青蒿素作用12 h后可见少量的ladder;   2: 20 μmol/L浓度青蒿素作用24 h后可见明确的ladder.

　　图5  青蒿素作用后U937细胞DNA电泳图（略）

　　2.6  青蒿素对U937细胞的诱导分化作用  形态学观察结果：阴性对照组U937细胞外形不规则；核大，染色质疏松，可见一个或多个核仁，核浆比例大. 经低浓度青蒿素处理的U937细胞形态产生明显变化，细胞体积变小，核染色质浓缩，核浆比例减小，胞质呈灰蓝色，原始细胞减少. NBT还原试验结果显示，2和5 μmol/L浓度青蒿素处理的U937细胞阳性率呈时间依赖性增高，并与剂量明显相关(P<0.01).  2和5 μmol/L浓度青蒿素处理5 d的U937细胞NBT还原试验阳性率分别为43%和57%(P<0.01).

　　2.7  青蒿素对U937细胞的IC50  青蒿素对U937细胞作用的IC50为22.47 μmol/L.

　　2.8  硝基蓝四氮唑（NBT）还原试验  NBT还原试验结果不同剂量组各时间点阳性细胞不一致（表1）.

　　表1  低浓度青蒿素对U937细胞诱导分化后NBT还原试验阳性率变化（略）

　　acP<0.05 vs空白对照， 2 μmol/L.

　　3  讨论    　　青蒿素是青蒿叶中分离的抗疟有效成份，具有过氧基团的倍半萜内酯，是我国首先发现的新构型的抗疟药，体内代谢活性产物为双氢青蒿素，抗疟活性高，毒性小［8］. 药动学研究证实青蒿素类药物在体内吸收快，分布广，排泄快. 毒理学证实其毒副作用轻微，毒性主要靶器官为骨髓，可致造血抑制，而这正是治疗白血病药物的特点之一. 1991年有学者首先报道了青蒿素及其衍生物对肝癌细胞及人胃癌细胞有选择性杀伤活性. 此后国内外的研究逐渐证实了青蒿素对结肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等恶性实体肿瘤细胞同样具有选择性抑制及杀灭效应，但均缺乏进一步的深入研究，包括作用机制等［9-10］. 研究还表明，青蒿素对多种多药耐药的肿瘤细胞同样具有显著的杀灭活性，对MDR1,MRP1和BCRP等耐药基因高表达的细胞系仍具有显著的活性. 初步的作用机制研究表明，肿瘤细胞膜是青蒿素作用的靶点之一，青蒿素可使肿瘤细胞内钙升高，致其凋亡. 同时，还可通过铁离子介导的细胞损伤、 细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡、抗血管生成作用等实现对实体瘤细胞的抑制以及杀灭作用［4］. 尽管目前青蒿素对于实体瘤作用效果显著，但对于血液系统肿瘤包括白血病的研究还比较少见［3］.     　　本研究的结果表明，青蒿素在＞6 μmol/L的浓度范围对U937细胞有着显著的抑制增殖、促进凋亡作用，且与作用时间和剂量有关，表现出明显的剂量时间依赖效应. 发现对于正常PBMNCs，青蒿素的有效抑制浓度要明显高于对U937细胞的抑制浓度，说明其对白血病细胞具有显著的选择性杀伤作用. 提示青蒿素可能比多数经典的化疗药物有着更显著的抗肿瘤活性，其应用于临床治疗白血病前景广阔. 恶性肿瘤的发生与肿瘤细胞增殖和分化之间的平衡失调有关，表现为增殖失控而分化受阻. 许多药物如维甲酸及某些天然成分可以促进白血病细胞向成熟分化，这也是目前治疗白血病的措施之一［11］. 可见，许多天然药物通过诱导白血病细胞分化来发挥抗白血病作用. 在分化诱导剂的作用下，U937细胞可向成熟粒细胞分化，表现为NBT 还原试验阳性. 本研究结果发现，在体外培养体系中，2和5 μmol/L的青蒿素均能使U937细胞形态发生改变，NBT还原试验阳性率也明显增高，呈时间与剂量依赖关系. 这表明在诱导分化剂量下，青蒿素还可通过诱导白血病细胞向成熟粒细胞分化，从而抑制其增殖，这可能是青蒿素抗白血病作用的机制之一. 以上特点表明，青蒿素是一种非常有前途的新型抗肿瘤药物［9-10］.

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