凝血酶研究概况

作者：赖翼，刘阳，林方昭，张容    作者单位：1. 成都医学院，成都 610083；Chengdu Medical College，Chengdu, 610083，China；2. 中国医学科学院 输血研究所，成都,610081

【关键词】  凝血酶、 结构、 生理功能、 分离纯化、 临床应用

早在19世纪末期，凝血酶就被一苏格兰的生理学家发现并命名，直到1951年凝血酶被纯化出来，并对其进行测序之后，人们对凝血酶的研究和了解才越来越深入。凝血酶的生理功能与其丝氨酸蛋白酶的活性有关，能裂解纤维蛋白原而形成纤维蛋白凝块，从而促进血液凝块的形成。20世纪中期，人们就开始将凝血酶应用于临床，由于其疗效显著，应用也越来越广泛。后来美英日等国从牛血浆中分离出凝血酶应用于临床，并证明将动物凝血酶应用于人体未出现凝血酶抗原性，口服和局部外用时未产生抗体的过敏反应和其他不良反应等，因而目前所使用的凝血酶制剂大多来源于动物血浆，传统的凝血酶分离纯化技术也趋于成熟。

    1  凝血酶的结构及生理功能

    1.1  凝血酶的结构  凝血酶是由凝血酶原活化变成的一种专一性很强的丝氨酸蛋白类水解酶，是机体凝血系统中的天然成分。凝血酶由308个氨基酸残基组成，分子质量为36 ku，它是一双链分子，含有A链和B链，两链间由二硫键连接。其中A链含49个氨基酸残基，又称轻链；B链由259个氨基酸残基组成，又称重链。A链氨基末端氨基酸是苏氨酸（Thr）；而B链氨基末端氨基酸是异亮氨酸（Ile），其最初的4个氨基酸残基是异亮氨酸颉氨酸谷氨酸甘氨酸（IleValGluGly）。A链位于分子的背部，虽然不带有活性位点。但近来的研究表明，A链对凝血酶整体结构的完整功能性起稳定作用[1]。而B链是其活性位点所在的部位，同时具有酶所有的功能结构域。B链上涉及凝血反应的功能区至少有3个，其一是精氨酸侧链口袋，由Ser－195，His－47，Asp－102构成的催化位点在这个部位[2]。其二是非极性结合位点，可以和底物发生疏水相互作用；其三是阴离子结合位点，它可能由凝血酶B链中的6个Lys构成(LysB 21，B 52，B 65，B 106，B 107，B 154)，它负责与底物(纤维蛋白原、血小板受体、凝血酶调节蛋白等)发生相互识别和相互作用[3]。并且在B链内有3个二硫键（Cys 42－Cys 58，Cysl 68－Cys1 82，Cysl 91－Cys 220)，它们起到稳定凝血酶结构的作用[4]。

    1.2  凝血酶的生理功能  凝血酶在体内以凝血酶原形式存在，在凝血过程中，凝血酶原复合物将其激活而转变为有丝氨酸蛋白类水解活性的凝血酶。凝血酶的形成在凝血过程中起到了中心作用。凝血酶形成后的作用至少包括以下5个方面[5]：（1）启动：一旦凝血酶形成后，便可迅速启动以后阶段的止凝血过程，包括作为促凝剂激活血小板、内皮细胞，并激活因子V、Ⅶ、Ⅷ。(2)放大：凝血反应的放大是通过促凝酶复合物在内皮下基质和周围血细胞表面合成而实现的。其中，凝血反应的放大主要是通过α凝血酶的激活来完成，同时，凝血的放大反应相又可促使生成更多的α凝血酶，并在血管受损伤处形成稳定的血栓，从而终止血液丢失。（3）血块形成的终止： 血块形成的终止至少涉及两个连续的抑制过程和一个动力学抑制过程。前者主要是蛋白酶抑制剂ATⅢ系统和组织因子途径抑制物（TFPI）系统。而动力学抑制系统则是通过蛋白C途径进行的。在蛋白C途径中，首先是APC的生成，而APC的形成则是通过α凝血酶与血栓调节蛋白（thrombomodulin，TM）所形成的复合物，即α凝血酶TM使PC变为APC。通过这一动力学抑制系统可灭活凝血酶原酶和内源性凝血酶成分，主要是辅因子蛋白如因子Va和Ⅷa的活性，从而参与终止血块的形成。（4）血块的清除：血块的清除是组织修复过程中的基本步骤，同时要求纤溶酶的参与。凝血酶对这一过程的调控是通过影响纤溶而间接对其产生影响的。通过TMα凝血酶复合物产生的TAFIa可降低由tPA及纤维蛋白激活谷氨酸纤溶酶原的速率，保护纤维蛋白免受降解。在APC存在时，α凝血酶的生存可显著减少，同时降低TAFIa的激活。（5）修复：对损伤组织的修复是凝血过程的最后一步。这一过程需要纤溶酶激活金属蛋白酶，后者可使受损的细胞外基质降解，并促使新生细胞迁移至受损伤部位。在这一过程中，凝血酶是一种强有力的生长因子和趋化吸引剂，其对成纤维细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞有激活效应；α凝血酶可激活血小板，使血小板释放血管活性物和生长因子，促进不同类型的细胞增殖和生长。

    2  凝血酶的分离纯化

    从血浆中分离纯化凝血酶包括血浆中凝血酶原的提取、凝血酶原的激活和凝血酶纯化几个步骤，以下从这几个方面对凝血酶的分离纯化技术作一介绍。

    2.1  粗凝血酶的分离  血浆中的成分非常复杂，除凝血酶外，还含有参与凝血过程的其他蛋白质，如纤维蛋白原、各种凝血因子等，以及不参与凝血过程的杂蛋白。粗凝血酶的提取即去除血浆中的纤维蛋白原等杂蛋白，同时保留凝血因子，有利于凝血酶原的激活。凝血酶原本身没有活性，不能将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，只有将其激活成凝血酶后才能在凝血级联反应中发挥作用。

    2.1.1   凝血酶原的提取  目前，凝血酶原的提取通常采用3种方法：等电点沉淀法、柠檬酸钡吸附法和氢氧化镁吸附法。

    等电点沉淀法根据蛋白质在溶液pH为其等电点的条件下溶解度最低的原理，用1％的醋酸将适当稀释后的血浆pH调至凝血酶的等电点5.0～5.5之间，静置分层后离心，缓冲液溶解沉淀后即得粗凝血酶原溶液。

    柠檬酸钡吸附法则根据柠檬酸钡能吸附依赖于维生素K的凝血因子这一特性，在柠檬酸钠抗凝获得的血浆中加入氯化钡产生柠檬酸钡，凝血酶原等因子随之沉淀分离出来，沉淀用EDTA解吸，再离心去沉淀后获得粗凝血酶原溶液。

    氢氧化镁吸附法由Seeger首次报道，以等电点沉淀法为基础，沉淀用氢氧化镁吸附溶解的沉淀物，以二氧化碳洗脱凝血酶原，再加硫酸铵至65％饱和度沉淀凝血酶原。

    以上3种方法相比，等电点沉淀法操作较简便，应用较多，但得到的粗凝血酶活性不高；后两种方法得到的粗凝血酶活性较前者有所提高，但操作比较繁琐。也有报道[6]提出将血浆先于-20℃冷冻处理，在4℃下恒温融化，能有效去除血浆中的部分纤维蛋白原和少量凝血因子；冷冻处理的同时破坏了血浆中脂质蛋白质的稳定乳化体系，更利于目标蛋白质的提取和分离，凝血酶的纯度和得率有所提高。

    2.1.2  凝血酶原激活  生理条件下，凝血酶由凝血酶原在凝血因子Ⅹa、凝血因子V、Ca2+和磷脂作用下激活生成。在缺乏某些激活因子的情况下，也能将凝血酶原转化为凝血酶，但是转化率很低。在从血浆中提取凝血酶的过程中，凝血酶原的激活是关键的一步。目前国内的研究多采用单独的Ca2+ 激活[7]，即在粗凝血酶原溶液中加入一定浓度的CaCl2溶液，室温下放置1.5～2 h，凝血酶活性达到最高，残留的纤维蛋白原转化为纤维蛋白后析出，过滤后即得活化的粗凝血酶溶液。

    2.2  粗凝血酶的纯化  通过以上步骤得到的粗凝血酶中仍有部分凝血因子等杂蛋白的残留，如凝血因子X等，要得到适合临床需要的凝血酶制品则还需要进一步的纯化。纯化的方法有很多种，传统的物理化学方法即丙酮沉淀法和硫酸铵分级盐析法[8]，这两种方法操作简便，成本低，但得到的凝血酶制品纯度不高，回收率低，应用上受到一定限制。与传统的物理化学方法相比，采用层析法分离血浆蛋白具有高特异性、高选择性的优点，能够用于血浆中一些微量物质的分离，以获得高纯度的适合临床需要的血浆制品，并且与沉淀法相比更易于自动化；同时，层析法纯化过程中还能起到去除血浆制品中的病原体的作用，从而提高血液制品临床使用的安全性[9]。目前纯化凝血酶的层析法主要采用凝胶过滤层析、离子交换层析和肝素亲和层析三种方法，下面将对这三种方法做一介绍。

    2.2.1  凝胶过滤层析  凝胶过滤层析是应用凝胶过滤介质分离不同大小的物质的一种技术，可用于相对分子质量从几百到106数量级的物质的分离纯化。该技术常用于蛋白质等生物大分子的分级分离和除盐。凝血酶的分子质量为36 ku，选择合适的过滤介质就能有效的去除其他杂蛋白。1997年，Oates等[10]在凝血酶的制备过程中采用了凝胶过滤层析以去除一些微量蛋白。许长法等[11]应利用DEAE纤维素柱和磷酸纤维素柱分离纯化粗凝血酶液，再经SephadexG100凝胶过滤，得到凝血酶电泳纯，比活力为1 610 u/mg，酶活力回收率为48.1％。肖丽霞等[12]用DEAE纤维素(DE32)柱层析和SephadexG100分子筛层析从猪血浆中纯化得到猪凝血酶，酶比活力为2 000 u/mg，纯化倍数为100，酶活力回收率为56％。凝胶过滤层析成本较低，操作简便，介质与被分离物质之间不发生化学反应，洗脱条件温和，不易使有效成分失活，是一种分离效果好、重复性高的纯化方法，但由于凝胶过滤层析仅根据溶质之间相对分子质量的差别进行分离，选择性低。因而，凝胶过滤层析应用最为普遍，尤其被广泛应用于分离纯化过程中的初级阶段以及最后成品化前的脱盐。

    2.2.2  离子交换层析  离子交换层析是利用蛋白质所带离子或表面电荷的区别，将目标蛋白吸附到DEAE、CM等离子交换柱上而达到去除杂蛋白的目的的一种方法。离子交换层析在治疗用血浆蛋白制品的制备中得到广泛的应用。在pH﹥5.5的条件下，凝血酶分子带负电荷，因此可用阴离子交换柱对其进行纯化。辛春艳等[13]应利用DEAE52离子交换层析纯化等电点沉淀法制备的粗凝血酶，所得凝血酶的比活为64.31 u/mg，每升血的得率为2 058 u。有美国专利介绍了先将凝血酶原结合到离子交换柱上，然后用钙离子激活，再洗脱凝血酶的一种分离纯化方法。Proba等[9]报道了一种经改进的基于阳离子交换层析的凝血酶纯化方法，现在这种方法正是SNBTS（the Scottish National Blood Transfusion Service）建议采用的纯化方法。离子交换层析是蛋白质、肽等生物产物的主要纯化手段，它的选择性远高于凝胶过滤层析法，产品回收率高，具有浓缩作用，应用范围广泛。另一方面，离子交换层析中影响分离特性的因素非常复杂，这种复杂性给目标产物的选择性高度纯化带来了机遇，但同时也增加了过程设计和规模放大的难度。

    2.2.3  肝素亲和层析  亲和层析是应用耦联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。凝血酶与低分子质量肝素之间有特异性的作用。利用它们之间的特异性亲和作用，可以将低分子质量肝素固定载体上，对凝血酶进行亲和层析纯化。1977年，Nordenman和Bjork[14]首次采用肝素亲和层析法对凝血酶进行了更进一步的纯化，以去除未活化的凝血酶原、活化的碎片和其他的凝血因子（如因子X、蛋白C和因子Ⅸ），并被应用于临床试验用凝血酶的生产。据现有的报道，该法用于凝血酶分离纯化所使用的亲和载体有壳聚糖、琼脂糖4B、SephadexCL6B。肖丽霞等[12]报道壳聚糖优于琼脂糖4B。史永昶等[15]用琼脂糖4B作为载体，通过亲和层析，将猪凝血酶粗品提纯了8.2倍，获得了比活超过1 100 u/mg凝血酶，收率为60％。王海亭等[16]利用SephadexCL6B作为亲和载体，采用亲和层析方法，对猪凝血酶粗酶进行纯化,使其比活提高了32.5倍，回收率为50.6％。肝素亲和层析与以上两种层析方法比较，它所应用的是生物学特异性而不是依赖于物理化学性质，因而是一种选择性更强、纯化效率更高的蛋白分离纯化的方法，非常适用于分离低浓度的待纯化蛋白，常常可以一步获得满意的纯化效果，能较快地获得高纯度、高活性的目的蛋白，但是成本较高。

    凝血酶分离纯化的每一步都有不同的方法。选择不同的组合方法，可以获得不同纯度的凝血酶。目前，生产用于临床止血的凝血酶，采用柠檬酸钡吸附分离、离子交换层析纯化或亲和层析纯化的组合方式获得凝血酶纯度较高。而要获得高纯度的凝血酶，则须采用柠檬酸钡吸附分离、多次离子交换层析纯化的方法。结合实际需求，制定合理的工艺方案就可以获得需要的凝血酶产品。

    3  凝血酶的临床应用

    在人体凝血反应过程中，凝血酶直接作用于纤维蛋白原使其转化为纤维状的不溶性纤维蛋白，网住外渗的血细胞最终形成血液凝块而完成止血过程。早在1939年，Seegers等人就已使用分离出的人凝血酶治疗肝脏出血等。随着医学和凝血酶分离纯化技术的发展，人们逐步认识到动物来源的凝血酶也可应用于临床治疗。上世纪80年代前后，美英日等国已从牛血中提取凝血酶制剂用于临床；90年代以后，国内从猪血中提取出凝血酶应用于临床，在越来越多的出血性疾病治疗和外科止血中发挥了重要的作用。

    凝血酶是局部止血的首选药物，常以干粉或生理盐水溶解后局部涂于伤处及手术处，在外伤和手术中能迅速达到止血目的。由于凝血因子异常所导致的牙龈、鼻腔出血等，在其他药物达不到止血效果时可改用凝血酶直接作用于出血处。目前，凝血酶在临床上的应用越来越广泛，对于发生急性消化道出血的患者可口服凝血酶使出血部位迅速止血；对难治性产后出血可采用液体喷洒或纱布按压的方式给予凝血酶止血治疗；在泌尿外科中可通过导尿管灌注凝血酶溶液和抗生素来治疗出血性膀胱炎，可同时达到止血和促进受损上皮组织再生修复的作用；在以往使医生感到头痛的耳鼻喉科疾病及相关手术出血的处理上，采用直接灌注凝血酶或用凝血酶液浸湿的明胶海绵敷贴出血处，可得到满意的止血效果，减轻病人痛苦。目前研究还表明，凝血酶不仅在脑出血、脑缺血中有毒性作用，在中枢神经系统正常发育和损伤保护中也有重要作用。在韩国玲、赵彦临床研究中表明小剂量凝血酶可产生神经保护作用，而大剂量则具有细胞毒性作用[17,18]。

    由于凝血酶所具有的止血快、无副作用的优点，其临床使用日渐广泛，将使目前十分紧俏的凝血酶更趋紧缺,生产前景看好。传统的工业生产凝血酶的技术已趋成熟，但受到血液资源的限制，随着市场需求的增大，传统的制备法已经远远不能满足需求。上世纪八九十年代开始，国外已开展了应用基因工程和细胞工程技术来生产凝血酶的研究，并取得了一定成绩，已成为未来凝血酶制备的一个发展方向，在现代生物制药产业中具有良好的前景。

【参考文献】[1] CRISTOFARO DR, AKHAVAN S, ALTOMARE C, et a1. A natural prothrombin mutant reveals an unexpected influence of the Achain’s structure on the activity of human αthrombin [J]. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(13): l303513043.

[2] CERA DE, Dang QD, AYALA YM. Molecular mechanisms of thrombin function[J]. CMLS, Cell. Mol Life Sci, l997, 53(8): 701730.

[3] PINEDA AO, SAVVIDES SN, WAKSMAN G, et a1. Crystal Structure of the Anticoagulant Slow Form of Thrombin[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(43): 4017740180.

[4] RAJESH SR, CHANG JY. Structural stability of human αthrombin studied by disulfide reduction and scrambling[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2003, l65l(12): 8592.

[5] 彭黎明, 邓承祺. 现代血栓与止血的实验室检测及其应用[M]. 人民卫生出版社, 2004.

[6] 周文静, 吕嘉枥. 从猪血中提取纯化凝血酶方法的改进[J]. 中国生物制品学杂志, 2005, 18(3): 199201.

[7] 辛春艳, 陈英珠. Ca2+激活猪凝血酶原作用的初步研究[J]. 河北省科学院学报, 2001, 18(3): 171173.

[8] 李良铸, 李明烨. 最新生化药物制备技术[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2002.

[9] JOHNSTON A, ADCOCK W. The use of chromatography to manufacture purer and safer plasma products[J]. , 2000, 17: 3770.

[10] OATES A, KUPCZYK M, KANELLOS J. WO, 97/04081.

[11] 许长法, 王兰仙. 猪凝血酶的分离纯化与鉴定[J]. 北京联合大学学报, 1994, 8(1): 4445.

[12] 肖丽霞, 史永昶. 猪凝血酶的分离纯化及部分性质研究[J]. 江苏农业研究, 1999, 20(3): 6366.

[13] 辛春艳, 陈英珠等. 从猪血提取凝血酶等生化产品的研究[J]. 河北省科学院学报, 2002, 19(4): 250253.

[14] NORDENMAN B, BJORK I. Purification of thrombin by affinity chromatography on immobilized heparin[J]. Thrombosis Research, 1977, 11: 799808.

[15] 史永昶, 马中良. 猪凝血酶的亲和层析纯化及其酶原的激活研究[J]. 江苏农学院学报, 1997, 18(54): 9799.

[16] 王海亭, 修朝阳. 凝血酶的亲和层析纯化技术[J]. 青岛科技大学学报, 2003, 24(3): 225228.

[17] 韩国玲, 姜亚军. 凝血酶的神经保护作用[J]. 国外医学脑血管疾病分册, 2004, 12(3): 234236.

[18] 赵彦, 刘发益. 凝血酶在中枢神经系统中的毒性和保护双重作用[J]. 国外医学生理、病理科学与临床分册, 2003, 23(1): 7073.