特发性血小板减少性紫癜患者血小板生成素及血小板相关抗体检测

作者：陈剑芳， 杨林花， 冯建军 ，刘秀娥，申秀敏    作者单位：1.山西医科大学第二医院血液科;2.山西医科大学第二医院体检中心，太原 030001  【摘要】  目的 检测特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者血小板生成素水平、T淋巴细胞亚群及血小板相关抗体的变化，探讨其在ITP发病机制中的作用及临床意义。方法 应用夹心酶联免疫吸附试验、流式细胞术分别检测50例ITP患者和24例正常对照血小板生成素浓度、T淋巴细胞亚群及血小板相关抗体的比值。结果 ITP患者的血小板计数为30.65±18.34×109/L明显低于正常对照组的226.63±45.63×109/L(P＜0.05)；血小板生成素水平二者的差异无显著性(分别为76.65±32.50 pg/ml，71.62±23.03 pg/ml，P＞ 0.05)；在T淋巴细胞亚群变化中，ITP患者CD 3+T淋巴细胞百分比、CD 4+T淋巴细胞百分比及CD 4+/CD 8+的比值分别为60.06±12.08% 、27.74±9.67%、1.11±0.34%，均明显低于正常对照组(分别为69.89±5.56%、35.87±4.07%、1.64±0.32%，P<0.05)，CD8+T淋巴细胞为31.12±12.49%则显著高于正常对照组(22.53±4.12%，P<0.05)；ITP患者血小板相关抗体PAIgG 27.19±17.43%、PAIgM 41.15±15.62%、PAIgA 33.18±16.37%，均显著高于正常对照组 (PAIgG 9.28±3.85%、PAIgM 16.78±9.26% 、PAIgA 22.12±8.86% ，P<0.05)。结论 血小板生成素、T淋巴细胞亚群及血小板相关抗体能较好地反映ITP的发病机制,对提高ITP诊断水平及指导临床治疗有一定的意义。

【关键词】  特发性血小板减少性紫癜； 血小板生成素； T淋巴细胞亚群； 血小板相关抗体

Detection of Thrombopoietin and Platelet Associated Antibody in the Patients with Idiopathic Thrombocytopenic Purpura

    CHEN Jianfang, YANG Linhua, FENG Jianjun, LIU Xiue, SHEN Xiumin

    (Department of Hematology, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan , 030001 China)

    Abstract： Objective   Detecting the level of thrombopoietin and the percentage of T lymphocyte subsets and platelet associated antibody in the patients with idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP), to investigate their  pathogenesis and  clinical significance.Methods   The level of thrombopoietin and the percentage of T lymphocyte subsets and platelet associated antibody in 50 ITP patients and 24 healthy controls were tested  by virtue of  sandwich enzymelinked immunosorbent assay and flow cytometry respectively. Results   Compared with the controls（226.63±45.63×109/L）, the counts of platelets in ITP patients（30.65±18.34×109/L，P＜0.05). However, there was no apparent difference of the level of thrombopoietin between ITP patients and health controls (76.65±32.50 pg/ml ，71.62±23.03 pg/ml respectively, P＞ 0.05). In T lymphocyte subsets, the percentage of CD 3+ T lymphocyte and CD 4+ T lymphocyte and the ratio of CD 4+/CD 8+ in patients with ITP (60.06±12.08% ,27.74±9.67%,1.11±0.34% respectively) were notably decreased than those healthy controls (of which those of control group were 69.89±5.56%,35.87±4.07%,1.64±0.32% respectively，P < 0.05)，but the percentage of CD 8+ T lymphocyte was significantly elevated (which were 31.12±12.49% and 22.53±4.12% respectively, P < 0.05). The percentage of  PAIgG,PAIgM,PAIgA were apparently increased in ITP patients (which were 27.19±17.43%,41.15±15.62% and 33.18±16.37% )than health controls (which were 9.28±3.85%,16.78±9.26% ,22.12±8.86% ，all P<0.05). Conclusion  Thrombopoietin  with  T lymphocyte subsets and platelet associated antibody in the patients with ITP,were reflect the pathogenesis of  ITP, could be able to improve the diagnosis and guide clinical therapy.

    Key words：  Idiopathic thrombocytopenic purpura； Thrombopoietin； T lymphocyte subsets； Platelet associated antibody

    特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP）是一种由体液免疫和细胞免疫异常导致血小板破坏增多、生成减少，临床上以皮肤黏膜出血为特征的血小板减少性疾病[1]。目前ITP发病机制的研究主要集中在血小板破坏增加和生成减少两个方面。血小板生成素水平、T淋巴细胞亚群变化及血小板相关抗体的产生能较好地反映这一疾病过程。本文通过检测ITP患者血小板生成素水平、T淋巴细胞亚群及血小板相关抗体的变化，探讨其在ITP发病机制中的作用及临床意义。

    1  资料与方法

    1.1   研究对象  50例ITP患者均为2008年4月至2008年10月我院门诊或住院病人，其中男15例，女35例，男:女=1:2.3，年龄16～76岁，平均年龄44岁。诊断均符合文献诊断标准[2]。24例正常对照为本院体检中心体检正常者,其中男6例,女14例，男:女=1: 2.3，年龄14～78岁，平均年龄43岁。

    1.2  材料与试剂  Quantikine Human Tpo Immunoassay试剂盒为美国R﹠D公司产品。CD 4-FITC/CD 8-PE/CD 3-PC5、CD 3-FITC/CD 16+CD 56-PE及阴性对照均为Coulter公司产品。FITC标记的羊F(ab)2抗 IgG（阴性对照）、羊F(ab) 2抗人IgG（γ）FITC、羊F(ab) 2抗人IgM（μ）FITC、羊F(ab) 2抗人IgA（α）FITC单克隆抗体均为Coulter公司产品。流式细胞仪为美国Coulter公司EPICS ELITE ESP，采用EXPO32分析软件。

    1.3  方  法

    1.3.1  夹心酶联免疫吸附试验检测TPO水平  取静脉血2 ml 分离血清或血浆，-80℃保存。标本一次性解冻，用Quantikine Human Tpo Immunoassay试剂盒行sandwich ELISA法检测TPO水平。用稀释液RD611 Concentrate 将标准品梯度稀释。在预先用特异性针对人TPO的鼠抗人单克隆抗体包被的96 孔微量板上加入检测稀释剂RD11，再加入标准品或标本200 μl，室温孵育3 h，洗板4 次后加入连接辣根过氧化物酶鼠抗人TPO 多克隆抗体，室温孵育1 h ，洗板4 次后加入底物液，避光室温孵育30 min ，再加入50 μl 终止液终止反应，于30 min 内用酶标仪在450 nm.处检测每孔的OD值，并用570 nm进行波长校正。根据标准曲线计算样本TPO 值（pg/ml）。

    1.3.2  流式细胞术检测T淋巴细胞亚群比值  采集空腹静脉血2 ml (EDTA抗凝)，取流式细胞仪专用试管2支，分别加入单克隆三色抗体CD 4-FITC/CD 8-PE/CD 3-PE-Cy5及CD 3-FITC/CD 16 CD 56-PE 5 μl，两管内均加入30 μl抗凝全血，30 μl PBS缓冲液混匀，室温下暗室避光孵育15 min。荧光标记后利用破红仪使红细胞溶解，1 200 r/min离心5 min，弃去上清液，500 μl PBS缓冲液悬浮，放于4℃冰箱，3 h内上机测定。检测采用多色标记法。使用波长为488 nm氩离子激发光为光源，以前向角、侧向角散射光双参数散点图对淋巴细胞群设门，收集10 000个淋巴细胞检测，光散射及荧光数据全部存盘，测试完成后通过EXPO 32v1.2B Analysis软件处理分析。结果以淋巴细胞表达Th、Ts、总T和NK细胞的阳性百分率表示。

    1.3.3  流式细胞术检测血小板相关抗体比值  采集空腹静脉血2 ml (EDTA抗凝), 1 000 r/min离心8 min，制备富血小板血浆(plateletrich plasma ，PRP)。取PRP 100 μl加入流式细胞仪专用试管中，加入PBS缓冲液500 μl混匀，离心2 000 r/min离心3 min，弃去上清液，加入等体积PBS缓冲液，反复洗涤3次。然后以PBS缓冲液重悬,调整血小板浓度至100×109/Ｌ。取4支流式细胞仪专用试管，每个检测管加入50 μl 悬浮血小板，再依次分别加入10 μl FITC羊F(ab) 2抗 IgG（阴性对照）、FITC羊F(ab) 2抗人IgG、FITC羊F(ab) 2抗人IgM、FITC羊F(ab) 2抗人IgA单克隆抗体，充分混匀，室温下避光孵育15 min。PBS缓冲液洗涤，弃去上清液，加500 μl PBS缓冲液悬浮，3 h内上机测定。采用双色标记法，使用波长为488 nm氩离子激发光为光源，以前向角、侧向角散射光双参数散点图对血小板群设门，以同型对照为阴性群，收集10 000个血小板检测，光散射及荧光数据全部存盘，测试完成后通过EXPO 32v1.2B Analysis软件处理分析。结果以血小板表面表达PAIgG、PAIgM、PAIgA的阳性百分率表示。见图1、图2。常规细胞染色法观察骨髓巨核细胞数，由专人计数核查。

    1.4  统计学处理方法  采用SPSS 12.0软件进行处理。数据以x±s表示，采用t 检验，P < 0.05 为差异有显著意义。

    2  结    果

    2．1  ITP组及正常对照组TPO检测结果  ITP组血小板计数明显低于对照组,差异有显著性(P＜0.05)。ITP组巨核细胞数为132.58±73.95/4 cm2，明显高于对照组(20.42±8.22/4cm2)，差异有显著性(P ＜0.05)，而ITP组TPO水平略高于对照组，差异无显著性(P＞ 0.05)。见表1。经相关分析发现TPO与血小板数目呈负相关（r=-0.445, P <0.05）。表1  ITP组及正常对照组TPO检测结果*与对照组比较P < 0.05  **与对照组比较P > 0.05

    2．2  ITP组及对照组T淋巴细胞亚群检测结果  ITP组CD 3+T淋巴细胞百分比、CD 4+T淋巴细胞百分比及CD 4+/CD 8+的比值均明显低于正常对照组(P<0.05)，CD 8+T淋巴细胞则显著高于正常对照(P<0.05)；NK细胞百分比明显低于正常对照组(P<0.05) 。见表2。表2  ITP组及正常对照组T淋巴细胞亚群、NK细胞检测结果 两组比较P<0.05

    2．3  ITP组及对照组血小板相关抗体检测结果  ITP组血小板相关抗体PAIgG、PAIgM、PAIgA均显著高于正常对照组 (P<0.05) 。见表3。表3  ITP组及正常对照组血小板相关抗体检测结果两组比较P< 0.05

    3  讨    论

    血小板破坏增多是由于B淋巴细胞产生的抗血小板抗体与血小板相关抗原结合形成抗原抗体复合物，通过其Fc端激活单核巨噬细胞或补体系统，使血小板破坏导致血小板数量减少和功能障碍所致。检测抗血小板抗体对于ITP的诊断、治疗有重要的应用价值。本文ITP组PAIgG、PAIgM、PAIgA均显著高于正常对照组,与文献报道一致[3]。

    ITP不仅有体液免疫异常, 而且存在细胞免疫异常。文献报道T淋巴细胞可以通过CD 8+ 的CTL细胞(cytotoxic Tlymphocyte)的细胞毒性作用直接破坏抗体包被的血小板[4]。CD 8+细胞是T抑制/杀伤细胞(Ts/Tc)的表面标志。CD 8+T细胞具有细胞毒效应,它能抑制T细胞活化，抑制B细胞产生抗体,起抑制细胞及体液免疫作用。研究表明，Th /Tc细胞的平衡在自身免疫性疾病的发生、发展过程中起重要作用[5]，Th细胞及Tc细胞亚群平衡失调促使B淋巴细胞产生抗血小板抗体破坏血小板。CD 4+细胞是T辅助/诱导细胞( Th /Ti)的表面标志。CD 4+ T细胞具有辅助T细胞转变成效应细胞、B细胞转化成浆细胞以及活化巨噬细胞等功能，起辅助、诱导细胞及体液免疫的作用。Th细胞是机体免疫应答的中心细胞，CD 4+ / CD 8+细胞( Th /Tc)比值变化反应机体的免疫功能状况,比例升高表明免疫功能亢进,比例降低表明免疫功能低下。据文献报道，ITP患者NK细胞活性减低，导致其对B细胞激活、增殖、分化和抗体应答的抑制能力下降，从而使B细胞异常活化，产生抗血小板抗体增加 [6]。本研究结果提示ITP患者体内存在细胞免疫调节异常。

    血小板生成减少的机制主要是通过B细胞产生的抗血小板抗体与巨核细胞结合引起巨核细胞成熟障碍，从而使巨核细胞数目与正常对照相近甚至轻度增多的同时血小板生成减少[7]。本研究中ITP组与对照组相比血小板明显减少同时巨核细胞明显增多。TPO作为一种刺激巨核细胞增殖、分化、成熟及促进血小板形成的细胞因子，主要由肝脏和肾脏产生，其主要受骨髓巨核细胞和血小板计数的双重调节[8]。TPO受体CMPL主要表达在巨核细胞血小板非淋巴造血系统，TPO在与巨核细胞或血小板特异性结合后随着巨核细胞发育障碍或血小板破坏同时也会降解。大量的临床研究显示，ITP患者血清或血浆的TPO水平与正常对照组相近或轻度增高[9]。本研究中ITP组与对照组相比血小板明显减少，巨核细胞明显增多，差异有显著性，而TPO水平略高于对照组差异无显著性。TPO浓度与血小板数目呈负相关，是由于血小板降低虽然减少了对TPO的吸附与降解，使血TPO水平升高，刺激骨髓巨核细胞增加，增加的巨核细胞又加速了TPO的降解所致，综合结果使得TPO水平与对照组差别无显著性。

    综上所述，联合检测TPO、T淋巴细胞亚群及血小板相关抗体的变化，对血小板减少性疾病发病机制的判断具有重要意义，可作为血小板减少性疾病鉴别诊断的有用指标。同时ITP患者三个指标联合检测可根据具体的发病机制对ITP患者实施定向干预方案。

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