雷公藤红素阻断全反式维甲酸导致的白血病细胞与内皮细胞黏附

【摘要】  全反式维甲酸（all-trans retinoic acid， ATRA）治疗急性早幼粒细胞白血病，引起白血病细胞与内皮细胞之间黏附增加，是发生维甲酸综合征的重要原因。本文观察雷公藤红素对这种黏附增加的影响。方法:用流式细胞术检测雷公藤红素对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vascular endothelial cell， HUVEC）在ATRA刺激下表达黏附分子的影响。用细胞黏附功能实验，检测雷公藤红素对ATRA导致的上述两种细胞之间黏附增加的影响。结果:ATRA能引起NB4细胞表面细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1， ICAM-1）表达增加，但可被雷公藤红素明显抑制（ P <0.01）。NB4细胞上清液能刺激HUVEC表达ICAM-1（ P <0.05）;而被ATRA处理过的NB4细胞上清液能明显刺激HUVEC表达选择素E（E-selectin）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1， VCAM-1）和ICAM-1等黏附分子（ P <0.01），雷公藤红素对其抑制率分别达25.3%、42.4%和61.0%。ATRA导致上述两种细胞之间黏附增加，雷公藤红素对其完全抑制。结论:雷公藤红素能抑制ATRA导致的白血病细胞与内皮细胞黏附，有可能用于维甲酸综合征的治疗。

【关键词】  雷公藤红素

　　维甲酸综合征是全反式维甲酸（all-trans retinoic acid， ATRA）治疗急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia， APL）过程中出现的一种具炎症性特征和能导致死亡的严重并发症。其发生机制虽不完全清楚，但一般认为，与ATRA导致白血病细胞与内皮细胞的黏附能力增加，进而使大量细胞浸润组织和器官有关［1～3］。最近，我们发现，雷公藤红素能抑制炎症因子活化的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vascular endothelial cell， HUVEC）表达黏附分子，并抑制内皮细胞与白细胞的黏附［4］，提示其有可能用于维甲酸综合征的治疗。本研究以急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4和HUVEC为细胞模型，观察雷公藤红素对ATRA导致NB4细胞与HUVEC黏附增加的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂 ATRA，Sigma公司产品，用无水乙醇溶解，贮存浓度为100 mmol/L， -20 ℃ 冰箱中保存。工作浓度为1 μmol/L，用培养液临时配制。雷公藤红素，上海中山医院药剂科提取及纯化，方法见文献［5］，DMSO溶解，贮存浓度为100 mmol/L， -20 ℃冰箱中保存，工作浓度为200 nmol/L，用培养液临时配制。荧光直标鼠抗人VCAM-1-PE和E-selectin-PE，美国BD公司产品;鼠抗人ICAM-1-FITC，法国Diaclone公司产品。

　　1.2 NB4细胞培养 NB4细胞由法国国家医学与健康研究院602研究单位提供（源自美国ATCC）。RPMI 1640（Invitrogen， 法国），10%小牛血清（Cambrex， 法国），1%青霉素-链霉素，37 ℃，5% CO2培养。取对数生长期的细胞进行实验。

　　1.3 HUVEC培养 HUVEC细胞由法国国家医学与健康研究院602研究单位提供。分离及培养方法见文献［4］。EBM2培养液（Invitrogen， 法国），加5%小牛血清，1%青霉素-链霉素，0.4%重组人纤维母细胞生长因子-B（recombinant human fibroblast growth factor-B， rhFGF-B）、0.1%重组人血管内皮生长因子（recombinant human vascular endothelial growth factor， rhVEGF）、0.1%长效胰岛素样生长因子（long R insulin-like growth factor， R3-IGF-1） 和0.1 %重组人上皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor， rhEGF），均为法国Cam-brex公司产品，37 ℃，5% CO2培养。取3～5代的HUVEC进行实验。　　　　1.4 NB4细胞上清液的制备 取对数生长期的NB4细胞，按终浓度为2×105/ml加入培养体系进行传代培养。设对照、雷公藤红素、ATRA、ATRA+雷公藤红素4组，均设复孔。37 ℃，5% CO2培养24 h。300 g 离心5 min，弃细胞，再1 200 g 离心 10 min ，收集上清，-20 ℃冻存。

      1.5 ATRA和雷公藤红素对NB4细胞黏附分子表达的影响 取对数生长期的NB4细胞，按终浓度为2×105/ml进行培养。设对照、雷公藤红素、 ATRA 、ATRA+雷公藤红素4组，均设复孔。 37 ℃ ，5% CO 2培养24 h［2］。选择素E（E-selectin）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion mole-cule-1， VCAM-1）和细胞间黏附分子-1（intercellu-lar adhesion molecule-1， ICAM-1）的表达情况用流式细胞术检测［4］。

　　1.6 NB4细胞上清液对HUVEC表达黏附分子的影响 取贴壁生长良好的HUVEC，按5×10 4/ml，接种于24孔培养板中，每孔1 ml。待细胞长满时，分别加入NB4细胞上清液（与培养液等体积），设对照组，均设复孔。E-selectin、VCAM-1和ICAM-1的检测同1.5。　　　　1.7 抗体标记 取1×10 5个细胞，PBS清洗两遍后，分别与荧光直标鼠抗人E-selectin-PE、VCAM-1-PE和ICAM-1-FITC，于4 ℃反应30 min，总体积20 μl。然后转移至含PBS的流式细胞仪测定管，总体积250 μl。

　　1.8 流式细胞术检测 FACS Calibur（美国BD公司）的发射激光由氩离子激光器产生，功率为 15 mW ，激发光波长为488 nm。FITC和PE荧光分别设在FL-1和FL-2荧光通道上，测定前用校准荧光微球校正仪器，每测定管收集10 000个细胞，采用Cell Quest软件进行结果分析。

　　1.9 细胞黏附功能实验 NB4细胞和HUVEC分别接受ATRA、雷公藤红素和NB4细胞上清液处理24 h后，按试剂盒（法国Molecular Probes公司）操作说明书进行。取5×105未处理或处理的NB4细胞，用PBS洗两遍后，悬浮于1 ml不含血清的 RPMI 1640培养液中。加5 μl荧光染料calcein AM于悬浮细胞，使calcein AM最后浓度为 5 μmol/L ，充分混匀后，置37 ℃孵育30 min。然后用预温的RPMI 1640洗两遍，重新悬浮并调整细胞浓度为 5× 10 5/ml。取标记好的细胞100 μl放于长满 HUVEC （未处理或处理）的96孔板内，于37 ℃孵育30 min，取出后，在摇床上轻轻震荡3 min，吸弃上清，然后用不含酚红的RPMI洗4遍后，每孔加200 μl PBS。用荧光读板机（BioTek，德国）读取结果（吸收光谱494 nm，发射光谱517 nm）。1.10 统计学方法 每组实验重复3次，用组间 t 检验对结果进行统计分析。

　　2 结果

　　2.1 ATRA诱导NB4细胞表达黏附分子及雷公藤红素的阻断作用 NB4细胞表面与细胞黏附相关的E-selectin和VCAM-1表达很低，ICAM-1有少量的表达。NB4细胞被ATRA诱导24 h后，其表面E-selectin 和VCAM-1的表达无明显变化（ P > 0.05），但ICAM-1的表达明显增加（ P < 0.01 ）。雷公藤红素不改变ATRA诱导后的NB4细胞表达E-selectin 和VCAM-1（ P >0.05），但能明显降低其ICAM-1的表达水平（ P <0.01）。见表1。

　　2.2 雷公藤红素对NB4细胞上清液刺激HUVEC 表达黏附分子的影响 HUVEC未接受刺激时， E-selectin、 VCAM-1和ICAM-1呈现为低水平表达。NB4细胞上清液刺激HUVEC 24 h后，不能增加HUVEC表面E-selectin和VCAM-1的表达 （ P > 0.05），但能使其ICAM-1的表达水平增加 （ P < 0.05 ）。ATRA诱导24 h后的NB4细胞上清液，能使HUVEC表面的E-selectin、VCAM-1和ICAM-1的表达均明显增加（ P <0.01）。对被ATRA诱导的NB4细胞上清液刺激的HUVEC表达E-selectin、VCAM-1和ICAM-1，雷公藤红素可明显抑制，其抑制率分别达到25.3%、42.4%和 61.0%。 见表2。

　　2.3 雷公藤红素对ATRA导致NB4细胞与 HUVEC 黏附能力改变的影响 与对照组相比，ATRA诱导24 h的NB4细胞，与HUVEC（未被NB4细胞上清液刺激）的黏附率约增加了（14.7±3.4）%。雷公藤红素+ATRA共处理的NB4细胞，其与HUVEC（未被NB4细胞上清液刺激）的黏附率下降至对照组的（96.1±0.2）%;被NB4细胞上清液刺激24 h的HUVEC，与ATRA诱导24 h的NB4细胞进行黏附，结果显示，与NB4细胞上清液组相比，ATRA诱导的NB4细胞上清液使 HUVEC 与ATRA诱导24 h的NB4细胞之间的黏附率增加了（81.5±15.3）%，而与NB4细胞上清液组相比，雷公藤红素能使其黏附率下降至（95.1± 18.4 ）%。见图1、2。

表1 ATRA诱导NB4细胞表达黏附分子及雷公藤红素的阻断作用（略）

　　Table 1 ATRA-induced expressions of adhesive molecules in NB4 cells and the blocking effects of tripterine

　　**P <0.01， vs control group;△△P <0.01， vs ATRA group.

　　表2 雷公藤红素对NB4培养上清刺激HUVEC表达黏附分子的影响（略）

　　Table 2 Effect of tripterine on expressions of adhesive molecules in HUVEC stimulated by conditioned medium of NB4

　　*P <0.05，**P <0.01， vs control group. CM: conditioned medium.

　　图1 NB4细胞不同处理后与HUVEC黏附（略）

　　Figure 1 NB4 cell adhesion to unstimulated

　　HUVECNB4 cells were cultured with 1 μmol/L ATRA， 200 nmol/L tripterine or the vehicle for 24 h before the adhesion assay. The results are ex-pressed as percentage of relative adhesion compared with the control and are mean±SD of three experiments.

　　图2 HUVEC不同处理后与NB4细胞（ATRA诱导）黏附（略）

　　Figure 2 HUVEC adhesion to ATRA-treated NB4 cells

　　HUVEC were cultured with NB4 cell conditioned medium （NB4-CM）， ATRA-NB4-CM， ATRA+tripterine-NB4-CM or tripterine-NB4-CM for 24 h before the adhesion assay. The results are expressed as percentage of relative adhesion compared with the con-trol and are mean±SD of three experiments.

　　3 讨论

　　多个研究表明，APL细胞的黏附能力增加、以及APL细胞与内皮细胞之间的黏附增加，是ATRA治疗引起维甲酸综合征发生的主要机制之一［1～3， 6］。因此，阻断黏附增加，被认为是治疗维甲酸综合征的策略之一。本研究首次发现，雷公藤红素能明显抑制ATRA诱导的NB4细胞表达黏附分子;抑制ATRA处理的NB4细胞上清液刺激HUVEC表达黏附分子;而且ATRA导致的NB4细胞与HUVEC 黏附增加，能被雷公藤红素完全抑制。雷公藤红素是一种从雷公藤中提取的三萜类单体，有很强抗炎能力［7～10］。 我们最近的研究结果显示［4］，对内皮细胞培养无毒性剂量（20～200 nmol/L）的雷公藤红素 ，能够通过阻断肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）和白细胞介素-1β（inter-leukin-1β， IL-1β）等炎症因子导致的核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB， NF-κB）向细胞核内转移，从而抑制被这些因子活化的HUVEC表达E-selectin、VCAM-1和ICAM-1等黏附分子。受此启发，本研究观察雷公藤红素对ATRA导致的APL细胞与内皮细胞黏附增加的影响，并且也采用 200 nmol/L 的雷公藤红素作为本实验剂量。本研究首先观察了雷公藤红素对ATRA导致的NB4细胞表面黏附分子表达增加的影响。发现ATRA导致NB4细胞表面黏附分子ICAM-1的表达明显增加（ P <0.01），与文献报道［2，11］相符，而雷公藤红素明显抑制ATRA诱导的NB4细胞表面ICAM-1的表达（ P <0.01）。而ICAM-1在ATRA引起的APL细胞之间的黏附聚集，以及APL细胞与内皮细胞之间的黏附中起重要作用［2，11］。事实上，APL细胞与内皮细胞之间黏附增加取决于两个方面:一是APL细胞表达黏附分子增加;二是内皮细胞表达黏附分子也增加。有报道， ATRA 导致APL细胞分泌IL-1β能力增加［12，13］，而IL-1β能活化内皮细胞，使其表面的E-selectin、VCAM-1和ICAM-1被诱导性表达增加，增强内皮细胞的滚动黏附、紧密黏附的能力［14］。在我们的研究中，ATRA本身无明显刺激HUVEC表达黏附分子作用，NB4细胞培养上清液也仅能增加ICAM-1的表达，但经ATRA诱导的NB4细胞培养上清液能明显刺激HUVEC表达E-selectin、VCAM-1和ICAM-1等黏附分子（ P <0.01），而雷公藤红素对其抑制率分别达到25.3%、42.4%和61.0%。这可能是雷公藤红素阻断了ATRA诱导的NB4细胞上清液中的炎症因子对HUVEC的活化能力。正如前述，细胞间黏附的本质是黏附分子的表达，雷公藤红素能抑制ATRA诱导NB4细胞表达黏附分子，抑制ATRA诱导的NB4细胞培养上清液刺激HUVEC表达黏附分子，提示雷公藤红素也可能会抑制两者之间的相互黏附，为此，我们进行了两种模式的细胞黏附功能试验。实验结果证实，ATRA诱导的NB4细胞与HUVEC（未被ATRA诱导的NB4细胞上清液刺激）黏附率增加了（14.7± 3.4）% ，雷公藤红素对其能完全抑制;ATRA诱导的NB4细胞与HUVEC（被ATRA诱导的NB4细胞上清液刺激）的黏附率增加了（81.5±15.3）%，而雷公藤红素对其亦能完全抑制。其抑制效果好于用单克隆抗体各自封闭HUVEC表面的E-selectin、VCAM-1和ICAM-1［2］。综上所述，雷公藤红素能明显抑制ATRA诱导的NB4细胞表达黏附分子、抑制ATRA诱导的NB4细胞培养上清液刺激HUVEC表达黏附分子、完全抑制ATRA导致的NB4细胞与HUVEC黏附增加等研究表明，雷公藤红素在阻断ATRA导致的NB4细胞与HUVEC黏附增加方面有显著效果，提示雷公藤红素作为中药单体，有望成为治疗维甲酸综合征的新药物，但实际效果有待动物实验和临床进一步证实。

【参考文献】  　 1Larson RS， Tallman MS. Retinoic acid syndrome: mani-festations， pathogenesis， and treatment. Best Prac Res Clin Haematol. 2003; 16（3）: 453-461.

　　2 Marchetti M， Falanga A， Giovanelli S， et al. All-trans-retinoic acid increases adhesion to endothelium of the hu-man promyelocytic leukaemia cell line NB4. Br J Haema-tol. 1996; 93（2）: 360-366.

　　3 Tallman MS， Andersen JW， Schiffer CA， et al. Clinical description of 44 patients with acute promyelocytic leu-kemia who developed the retinoic acid syndrome. Blood. 2000; 95（1）: 90-95.

　　4Zhang DH， Marconi A， Xu LM， et al. Tripterine inhibits the expression of adhesion molecules in activated endo-thelial cells. J Leukoc Biol. 2006; 80（2）: 309-319.

　　5 Morota T， Ogino T， Katsuhara T， et al. D: A-friedo-24-noroleanane triterpenoids fromTripterigium wilfordii. Phytochemistry. 1995; 39（5）: 1159-1163.

　　6 Tallman MS. Retinoic acid syndrome: a problem of the past? Leukemia. 2002; 16（2）: 160-161.

　　7 Li H， Jia YF， Pan Y， et al. Effect of tripterine on colla-gen-induced arthritis in rats. Zhongguo Yao Li Xue Bao. 1997; 18（3）: 270-273. Chinese with abstract in Eng-lish. 力弘， 贾永锋， 潘雁， 等. 雷公藤红素对胶原性关节炎的作用. 中国药理学报. 1997; 18（3）: 270-273.

　　8 Liu RL， Liu ZL， Li Q， et al. The experimental study on the inhibitory effect of tripterine on airway inflammation in asthmatic mice. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2004; 27（3）: 165-168. Chinese with abstract in Eng-lish.刘瑞麟， 刘忠令， 李强， 等. 雷公藤红素抑制支气管哮喘小鼠气道炎症的实验研究. 中华结核和呼吸杂志. 2004; 27（3）: 165-168.

　　9 Li H， Zhang YY， Huang XY， et al. Beneficial effect of tripterine on systemic lupus erythematosus induced by active chromatin in BALB/c mice. Eur J Pharmacol. 2005; 512（2-3）: 231-237.

　　10 Allison AC， Cacabelos R， Lombardi VR， et al. Celas-trol， a potent anti-oxidant and anti-inflammatory drug， as a possible treatment for Alzheimer's disease. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2001; 25（7）: 1341-1357.　　　　11 Larson RS， Brown DC， Sklar LA. Retinoic acid induces aggregation of the acute promyelocytic leukemia cell line NB-4 by utilization of LFA-1 and ICAM-2. Blood. 1997; 90（7）: 2747-2756.

　　12 Behringer D， Schauffer J， Kresin V， et al. Differentia-tion associated modulation of the cytokine and chemokine expression pattern in human myeloid cell lines. Leuk Res. 2001; 25（2）: 141-149.

　　13 Jiang GS， Bi KH， Tang TH， et al. Cytokine secretion in patients with acute promyelocytic leukemia after treat-ment with all-trans retinoic acid. Bai Xue Bing Ling Ba Liu. 2003; 12（1）: 11-14. Chinese with abstract in Eng-lish.姜国胜， 毕可红， 唐天华， 等. ATRA对原代APL细胞分泌细胞因子影响的研究. 白血病·淋巴瘤. 2003; 12（1）: 11-14.　　　　14 Brown DC， Tsuji H， Larson RS. All-trans retinoic acid regulates adhesion mechanism and transmigration of the acute promyelocytic leukaemia cell line NB-4 under physiologic flow. Br J Haematol. 1999; 107（1）: 86-98.