肾癌G250抗原蛋白多糖（PG）区蛋白cDNA的克隆和序列测定

作者：郑典宝，郑骏年，郝林，武艺，刘俊杰，裴东生，胡书群，陈家存，孙晓青 【关键词】  序列分析　　摘要 :目的  克隆肾癌G250抗原蛋白多糖（PG）区cDNA，为制备G250杂交瘤及抗G250的单克隆抗体奠定基础。 方法  从肾癌细胞786-0中提取总RNA，以RT-PCR方法扩增出全长360bp的G250抗原PG区cDNA，将其与表达载体pCA13连接，转化大肠杆菌JM109，构建G250抗原PG区cDNA克隆。 结果  酶切及序列分析表明，与GenBank报道的G250抗原PG区cDNA序列完全一致。 结论  G250抗原PG区cDNA已成功地得到克隆。 　　关键词 :G250抗原;PG区蛋白;cDNA克隆;序列分析    Cloning and sequencing of the cDNA of PG region protein of G250antigen　　ZHENG Dian-bao，ZHENG Jun-nian，HAO Lin，et al    　　（Department of Urology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221002，China）Abstract:Objective To obtain the cDNA of proteoglycan（PG）region protein of G250antigen to get ready for preparing the hybridoma and monoclonal antibody of G250antigen.Methods The total RNA was extracted from human renal carcinoma cell line786-0and the intact cDNA of PG region protein was amplified by RT-PCR.The cDNA was cloned into pCA13vec-tor and transformed into E.coli JM109.Results The sequence determined was completely consistentwith the published PG re-gion protein cDNA.Conclusion PG region protein cDNA has been cloned successfully.    　　Key words:G250antigen;proteoglycan（PG）protein;cDNA cloning;DNA sequencing       　　肾癌（RCC）占肾恶性肿瘤的85%以上，居泌尿系肿瘤第2位，其中90%为透明细胞癌。肾癌位置隐蔽，早期不易发现，虽然近年来影像技术发展迅速，但早期诊断仍很困难。同时，肾癌恶性度极高且对放、化疗均不敏感。因此，临床上期待出现能早期诊断肾癌和治疗效果更好的新技术。1986年，荷兰科学家Oosterwijk［1］发现了一种新的肾癌相关抗原G250并对其进行了系统、深入的研究，发现G250抗原具有良好的肾癌特异性。G250单克隆抗体介导的肾癌早期诊断及生物治疗已应用于临床且取得一定疗效。本实验克隆出G250抗原PG区蛋白cD-NA，并进行了序列测定，为制备G250杂交瘤及抗G250单克隆抗体奠定基础。     　　1 材料和方法     　　1.1 主要材料  总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、核酸限制性内切酶XhoⅠ、HindⅢ以及T4DNA连接酶均购自Promega公司;人肾癌透明细胞株786-0、E.coli菌株JM109和质粒pCA13为本室保存。     　　1.2 总RNA提取  取786-0细胞1×10 5 ，按试剂盒说明提取总RNA。总RNA沉淀溶于100μl无核酸酶的水中，-80℃保存。     　　1.3 引物的设计与合成  根据发表的人肾癌G250抗原cDNA序列，设计PCR引物。上游引物:5′-ATCCCCAAGCTTGCCCCCGGATGCAGGAG-3′，引入了1个HindⅢ酶切位点。下游引物:5′-CCAC-CGCTCGAGTGAAGCGGCCCGCGCAG-3′，引入了1个XhoⅠ酶切位点（加下划线处为酶切位点）。引物由Invitrogen公司合成。     　　1.4 RT-PCR  加入总RNA20μg作为模板，上、下游引物至终浓度1μmol.L，用Promega公司的RT-PCR系统进行反转录及PCR扩增。反应条件为:94℃30s，60℃1min，68℃2min，40个循环。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。    

　1.5 cDNA的克隆及扩增  PCR扩增产物经酚-氯仿抽提纯化，HindⅢ和XhoⅠ双酶切及低熔点琼脂 糖凝胶电泳回收后，用酚-氯仿抽提纯化。然后与相同酶切并经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化的pCA13质粒室温连接5h，用连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，氨苄青霉素平板筛选，37℃培养过夜。利用pCA13中的抗氨苄青霉素基因，筛选出阳性菌落，挑取单克隆菌落，在LB培养基中小量扩增，按Promega公司的试剂盒说明书提取质粒，酶切鉴定。     　　1.6 G250抗原PG区蛋白cDNA序列分析  由上海基康生物技术有限公司进行测序。     　　2 结果     　　2.1 G250抗原PG区蛋白的RT-PCR产物分析  将RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见一清晰特异扩增带，约360bp，其大小与理论预期值一致（图1）。     　　2.2 G250抗原PG区蛋白的cDNA克隆与鉴定  RT-PCR产物经HindⅢ和XhoⅠ双酶切后，与相同酶切的PCA13连接，转化E.coli JM109，经氨苄青霉素平板筛选得到阳性克隆，提取质粒后再经HindⅢ和XhoⅠ双酶切鉴定，可见约6.9kb的载体片段及360bp的插入片段（图1）。 　　图1  电泳分析RT-PCR扩增的产物和PCA13-PG质粒限制性酶切图谱（略）    　　1.PCA13-PG质粒双限制性酶切图谱        　　2.PCA13质粒单限制性酶切图谱        　　3.1kb DNA ladder        　　4.电泳分析RT-PCR扩增的产物

　　2.3 G250抗原PG区序列分析  对经酶切鉴定初步确认的阳性克隆测序。结果显示其序列与Gen-Bank发表的肾癌G250抗原PG区蛋白cDNA序列完全一致。

　　3 讨论       　　免疫组化研究表明，85%以上的原发性肾癌和转移性肾癌表达G250抗原，而占肾癌90%的透明细胞癌几乎全部表达此抗原［1］489-494 ;另外，宫颈癌、卵巢癌、结肠直肠癌、食管癌、膀胱癌及正常的消化道黏膜细胞和大胆管［1］489-494 上也有G250抗原的表达，而包括正常的肾组织在内的其他组织则不表达G250抗原。因此G250抗原可成为肾癌的特异性抗原［2］ 。国外利用131 I标记G250-McAb定位肾转移癌，结果90%以上的转移癌，包括肝、肺、骨及淋巴结转移均被发现，有些仅8mm没有被CT及MRI发现的肿瘤亦被显示［3］ 。Memorial Sloan-Kettering癌症研究［4］ 中心进行131 I-mAb G250治疗肾癌的Ⅰ.Ⅱ期临床试验发现，33例中17例治疗后病情稳定，2例出现肿瘤消减。因此G250抗体在肾癌诊断及治疗中的应用具有远大前景。      　　G250抗原是碳酸酐酶Ⅳ蛋白，位于细胞膜上，是一种跨膜糖蛋白，由459个氨基酸构成。其中38个氨基酸（AA1-37）构成N端信号肽（SP），377个氨基酸（AA38-414）构成胞外区，20个氨基酸（AA415-434）构成跨膜区，25个氨基酸（AA435-459）构成细胞内的C末端。细胞外区又分为2个部分:蛋白多糖区（PG）和碳酸酐酶区（CA），并作为抗体结合部位与抗G250抗体结合［5］ 。但是人G250抗原CA区与鼠的CA区同源性高达80.5%，而PG区仅有59.4%，并且应用抗G250单克隆抗体M75证实其主要与PG区表位结合［6］ ;因此，应用PG区蛋白作为抗原来免疫BALB.C小鼠，比用完整G250抗原蛋白或PG加CA区蛋白在基因工程操作上更容易，并且可以达到几乎相同的免疫效果。      　　G250抗原PG区蛋白cDNA序列的成功克隆，有助于下一步表达PG区蛋白，并为以此为抗原制备G250杂交瘤及单克隆抗体奠定了基础。      　　〔致谢:感谢徐州医学院生物化学教研室张光毅教授，孙亚峰、纵艳艳、赵文君老师的无私帮助〕

参考文献 :    　　［1］ Oosterwijk E，Ruiter DJ，Hoedemaeker PJ，et al.Monoclonal antibody G250recognizes a determinant present in renal-cell carcinoma and ab-sent from normal kidney［J］.Int J Cancer，1986，38（4）:489-494.

　　［2］ Uemura H，Nakagawa Y，Yoshida1K，et al.MN.CA IX.G250as a po-tential target for immunotherapy of renal cell carcinomas［J］.Br J Can-cer，1999，81（4）:741-746.    　　［3］ Oosterwijk E，Bander NH，Divgi CR，et al.Antibody localization in hu-man renal cell carcinoma:a phaseⅠstudy of monoclonal antibody G250［J］.J Clin Oncol，1993，11（4）:738-750.    　　［4］ Divgi CR，Bander NH，Scott AM，et al.PhaseⅠ.Ⅱradioimmuno-therapy trial with iodine-131-labeled monoclonal antibody G250in metastatic renal cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，1998，4（11）:2729-2739.    　　［5］ Grabmaier K，Vissers JL，De Weijert MC，et al.Molecular cloning and immunogenicity of renal cell carcinoma-associated antigen G250［J］.Int J Cancer，2000，15（6）:865-870.    　　［6］ Zat′ovicova M，Tarabkova K，Svastova E，et al.Monoclonal antibodies generated in carbonic anhydrase IX-deficient mice recognize different domains of tumour-associated hypoxia-induced carbonic anhydrase IX［J］.Immunol Methods，2003，282（1-2）:117-134.