法尼酯衍生物X受体活化对肝星状细胞TIMP-1、TIMP-2及MMP-2表达的调节作用

肝纤维化是多种慢性肝脏疾病发展至肝硬化的必经阶段，是肝脏受到慢性损伤时，肝脏细胞分泌与降解细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)失衡，导致ECM在肝细胞间隙可逆性沉积的结果。据现有资料报道，目前针对肝纤维化治疗的药物有:秋水仙碱、糖皮质激素、y一干扰素、二甲基前列腺素E2、维甲酸、马洛潜醋及多不饱和卵磷醋等等。尽管这些药物在体外研究中均证明有抗肝纤维化作用，但临床治疗效果不尽人意。随着肝硬化发病率的增加，如何对肝纤维化进行防治成为临床难题。法尼醋衍生物X受体(farnesoidXreceptor,FXR)是一种在肝肠系统等组织器官表达的胆汁酸受体，属于激素核受体超家族的一员，在胆汁酸代谢及胆固醇代谢中发挥重要作用。GW4064是一种合成的FXR配体，其活性是天然配体的数倍。本研究应用G}'4064处理大鼠肝星状细胞株HSC一T6，观察FXR激活后对肝星状细胞表达基质金属蛋白酶组织抑制因子一1(tissueinhibitorofmatrixmetalloproteinase一1，TIMP一1)、TIMI'一2及基质金属蛋白酶一2(matrixmetalloproteinase一2,MMP一2)的影响。1材料与方法1.1材料与试剂HSC-T6细胞株购自中国医学科学院肿瘤研究所。DMEM培养基购自HyClone公司。G4064购自TocrisBioscience公司。TrizolRNA抽提试剂盒购自天根公司。RT(逆转录)试剂盒购自Fermenta*公司。SY'BRPremixEXTaqT'_VIII购自I'aKaRa公司。蛋白酶裂解液RIP:A及PMSF购自博彩公司。TIMP一1兔抗大鼠多克隆抗体、'I'1MP一2小鼠抗大鼠单克隆抗体、MMP一2小鼠抗大鼠单克隆抗体及日一actin小鼠抗大鼠单克隆抗体均购自SANTACRUZ公司。过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗及过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均购自北京中山金桥生物技术有限公司。ECL试剂盒购自PIERCE公司。1.2方法1.2.1细胞培养HSC一T6细胞株在含100U/ml青霉素，100到ml链霉素和10%热灭活小牛血清的DMEM培养基里，在370C,5%的C0,培养箱培养，2d更换1次培养基。待细胞到对数生长期，以lx106/孔接种在六孔板继续培养。分别应用不同浓度GW4064(0,O1,0.1,1},mol/L)混合10%热灭活小牛血清的DMEM或仅用生理盐水混合10%热灭活小牛血清的DMEIVl处理HSC一T618h。按照TrizolIAN}1抽提试剂盒说明书抽提各组细胞的总R}ra及按RT(逆转录)试剂盒说明书合成cD>V.A在一20℃冰箱保存备用。按照蛋白酶裂解液RTPA及PMSF说明书抽提总蛋白，并按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书计算样品蛋白浓度后一20℃冰箱保存备用。1.2.2实时荧光定量PCR法参考文献并应用Primer3一output软件验证PCR引物，所有PCR引物见表1。在hightCycler480实时荧光定量PCR系统(Roche公司)进行操作。PCR反应预变性95℃30，变性95℃10，退火60℃30s，反应40个循环。每个墓}1甭有操作3次.ice用2一“胡法分析结果。1.2.3WesternBlot法进行常规配胶、蛋白变性及土_样、蛋白电泳、转膜及封闭操作后，TIMP一1一抗(1:500),TIMP一2一抗(1:500)及MMP一2(1:500)4℃卵孚育过夜后室温孵育1h，洗膜后二抗(1:3000)室温孵育2h后洗膜，按ECL试剂盒说明书操作显影后运用分析软件(2uantitvone分析条带灰度值计算蛋白相对表达量。1.2.4统计学分析运用SPSS12.0软件进行统计学处理。结果以均数土标准差表示，组间均数比较采用(One一WayANOVA单因素方差分析法，两两比较采用LSD一t检验。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1GW4064对HSC一T6表达FXR,T1MP一1及TIMP一2的影响FXRrnRN_4表达在0.01N,mol/I,G}}4064组与对照组及0.1N.,mol/LGW4064组比较差异有统计学意义(P=0.000)，而在0.1N,,mol/LG}%4064组与1}.r,mol/LGW4064组比较差异无统计学意义(P=0.495)。TIMP一1和TIMP一2mRNA表达在0.Ol..t,mol/LG`V4064组与对照组比较差异无统计学意义(TlMP一1;P=0.817;TIMP一2;P=0.059)，在0.1N,mol/LG}l'4064组与对照组及mol/LGW4064组比较差异均有统计学意义(PIMP一1;Y二0.000及P二0.000;TIMP一2:P=0.001及P=0.000(表2)。TIMP一I和TIMP一2蛋白表达在0.0I}.mol/LGW4064组与对照组比较差异无统计学意义('TIMP一1:P=0.355;TIMP一};P=0.078，在0.1N,,mol/I.GW4064组与对照组及1,mol/LGW4064组比较差异均有统计学意义('TIMI'一1;P=0.007及P=0.024，TLMP-2，P=0.009）(表3，图1)。3讨论正常肝脏中F:t;M的合成与降解存在动态平衡在损伤囚索持续作用下，肝星状细胞大y活化增殖及合成分泌大量ECM,导致ECM合成与降解失衡,最终ECM大量沉积导致肝纤维化,肝纤维化继续进展则发生肝硬化→Ⅱ.在我国肝硬化为仅次于脑血管意外、心血管疾病和恶性肿瘤的主要病死原因之一。肝纤维化时肝脏的ECM沉积成分主要为I、Ⅲ型胶原,而Ⅳ型胶原不是主要成分,但后者主要沉积于肝窦内皮细胞周围,1Xl型胶原的过度沉积能导致肝窦毛细血管化,改变F肝脏血流和结构从而囚肝脏的缺血缺氧加剧肝脏的损苫('MMP是一类降解ECM的酶,而ηMP则可通过抑制MMP的活性来减少ECM的降解。其中TLMP-I与1′IMP~2在肝纤维化中对MMP活性的抑制作用最引入关注,研究已表明TlMP-1可由肝星状细胞分泌,目具有抑制多种MMP的作用,△MP-1在肝脏持续损伤时表达增加,并且能持续活化肝星状细胞,促进肝纤维化的发展;TIMP~2则是MMP-2的主要抑制囚子,肝纤维化时其表达明显增加,抑制了MMP-2的活性,从而加剧Ⅳ型胶原的沉积,且rΓ1MP~2尚具有抑制其他所有激活MI〉P的蛋白水解活性的作用[671。MMP~2则主要位于肝窦内皮细胞、血管内皮细胞及肝窦细胞,在细胞表面通过膜型基质金属蛋白酶被激活,活化的MMP-2即具各降解肝组织内的Ⅳ型胶原、层粘连蛋白及巢蛋白等ECM的作中从而有利于减轻肝纤维化。XR是一种在肝肠组织表达的胆汁酸受体,属于核受体超家族9在胆汁酸及胆固醇代谢中发挥重要作用。当FXR配体与FX1R结合后,FⅩR空间构象发生改变并与视黄醛衍生物受体形成异源二聚体,最后与靶基因反应元件结合来调控靶基囚的转录。目前合lJicFXR配体与ⅩR结合力比天然配体强数倍[9i,因此常用于实验研究。已有国外研究发现原代培养的大鼠肝星状细胞随着其活化,T1MP-1和TIMP-2活性明显增强,但MMP-2活性则无明显改变;FXR配体6-ECDCA能使胆管结扎所致的小鼠肝纤维化模型表达mMP~1和TIMP-2减少70%~80%,臣可以增强MMP-2的活性,使得ECM降解增加,可能具有治疗肝纤维化的作用[3J。本研究发现GW4064通过增加F、ⅩR滔性,能导致HSC-%细胞株TIMP-1及TMP-2表达减少,因此T1MP对MMP降解ECM的抑制作0ll减弱,使MMP降解ECM能力增强,从而减少ECM的沉积来缓解肝纤维化,这与FⅩR配体在小鼠肝纤维化模型的研究结果一致。同时本研究还发现,FⅩR活化后HSC-%的MMP-2表达明显增加,从而使lⅤ型胶原降解增加,因此沉积在肝窦基底膜内的IV型胶原减少,肝窦毛细血管化及肝脏1ll流和结构改变减轻,改善肝细胞的营养物质交换,降低了肝脏的损害。Romcci等[m]的研究发现6-ECD()A能使胆管结扎所致的小鼠肝纤维化模型MMP-2活性增强,但却没有上调MMP-2mRNA的表达,但本研究却发现GW40“浓度在1un。l/1·时能上调HsC-⒎I⒗的MMP-2的表达,这可能与GW4O64对肝脏不同细胞作用机制不同有关。综上所述,GW4064通过增强ⅩR活性,下凋了肝星状细胞TIMP-1及TIMP-2的表达,上调MMP-2表达,这能使过多沉积的ECM降解增多,有益于肝纤维化的治疗。但也有研究认为MMP-2活性增强能损伤肝脏Disse腔隙基底膜,造成大量肝星状细胞活化,导致肝脏I型胶原及Ⅲ型胶原沉积增加而促进肝纤维化进展。因此,FⅩR活化后肝星状细胞增强的MMP-2活性对肝纤维化的影响尚需进一步研究。参考文献:Urtasun R,Lopategi A,George J. 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