microRNA-21、PTEN、NF-κB、Caspase-9在结肠癌中的表达及意义

结肠癌的发病是一个多因素、多步骤的演进过程近年来研究证实microRNA(微小核糖核酸，miRN:A1与结肠癌密切相关，为其诊断和分子靶向治疗提供了新的思路笔者通过研究正常结肠劲膜、良性结肠腺瘤、进展期结肠癌中miR-21的表达及与靶标2的对应调节关系，以期进一步深人探讨miR-21与结肠癌发展的关系。现报告如下。1资料与方法1.1一般资料选取湘雅医院普外科2Q12年4月至7月临床资料完整的手术切除结肠癌标本60例，男42例，女18例，年龄50一71(63.1317.55)岁。术前均未行放、化疗及免疫治疗。根据Tl}M分期分为y}期14例，III/I}'期46例;肿瘤浸润深度:Tt/'I':期19例，}3/T4期41例;按术后病理分为高/中分化23例，低分化37例。收集结肠镜下良性结肠腺瘤20例，其中男13例，女7例，年龄48一70(62.74士5.78)岁。另取20例正常结肠私膜组织作对照，其中男IS例，女5例，年龄44一75(60.25士6.35)岁。后两组性别和年龄均与结肠癌组配对。1.2方法1.2.1逆转录聚合酶链式反应(RT-PCPL),microRNA法抽提总RNA，逆转录合成。DNA;5-GTCGTAT(CAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGC1ATTGCACTGGATACGACTGAACA'I'C-3'〔取2闪cD'\A扩一增miR-21(67hp)，同时扩增GAPDH(101by)作为内参。rniR-21引物序列一a一为:上游引物:5'-ACACTC-CAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3';下游引物:5'_GTGTCGTGGACJTCGGCAATTG-3'}GAPDH引物序列为:上游引物:5'-CAG(}GCTGCTTT'T}}CTCTGG-TAA-3';一下游引物:5'-GGGTGGAATCA'I'ATTGGAA-CATGT-3'。取5闪PCPL扩增产物电泳，凝胶成像仪拍照，计算miR-21与内参平均吸光度(A)值，以两者吸光度比值作为目的基因相对表达量1.2.2-免疫组织化学检测PTEN,1}''F-KB,Caspase-9表达浓缩型鼠抗人I'TEN,NF-KB(p6}),Caspase-9单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，采用SP法行免疫组织化学染色.F'TE}V蛋白阳性位于细胞核内5',NF-KB(p65)蛋白阳性位于细胞浆和细胞核内aspase-9蛋白阳性位于细胞浆内5,，呈棕黄色颗粒状染色。高倍镜(10x40)下随机取5个视野，判定标准:阳性细胞百分比计数:蒸10%(0分)，11%一25%(1分)，26%一>0%r(2分),51%}75%(3分)，,76%(4分)染色强度评分:无染色(0分)，淡染色(1分)，棕黄色(2分)，棕褐色(3分)。以两项积分和<3分为阴性，,3分为阳性。1.2.3荧光染色检测细胞凋亡百分率细胞凋亡Hoechst33258试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司。常规包埋组织切片，脱蜡、透明，PI3S洗涤后染色，荧光显微镜检测到蓝色的细胞核。记数5个以__仁高倍视野(10x40)不少于1000细胞，计算凋亡细胞百分比。1.3统计学处理采用SPSS13.0软件.计量资料以x1表示，采用单.因素方差分析(Student-Vew_man-Keuls法)，计数资料比较采用才检验P<0.O5为差异有统计学意义。2结果2.1正常结肠私膜、结肠腺瘤及结肠癌中而R-2PTE从}VF'-rcB,Caspase-9表达及调亡细胞百分率比较miR-21mRNA及NF-KB阳性表达率在正常私膜、结肠腺瘤及结肠癌中依次递增，PTFN,Caspase-9阳性表达率及凋亡细胞百分率在上述三种组织中依次递减，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1,图1一2。2.2miR-21与病理参数间关系miR-21与TNM分期、浸润深度、分化程度呈正相关(r二0.647,0.297,0.259，均P<0.OS)。2.3miR-21与PTEN,NF-KB,Caspase-9表达及凋亡细胞百分率相关分析miR-21与NF-KB表达呈正相关(/二0.519);与PTEN,Caspase-9表达及凋亡细胞百分率呈负相关(r=一0.299,一0.388,-0.931，均P<0.O5)。3讨论miRNA通过裂解或抑制靶mRNA的翻译行使抑制功能，其失调可影响到肿瘤的发生。已发现多种miRNA在结肠癌中高表达，如miR-21,let-7b,miR-9等。Schetter等检测197例结肠癌组织中miRNA的表达，发现miR-20a,miR-21,miR-106a表达升高，以miR-21升高最显著，且与较差的分化及较低的生存率相关。Yamamichi等9分析了miR-21在结肠癌不同期别中的表达，发现miR-21的表达从癌前病变到晚期癌逐渐增加。本实验中miR-21的表达在正常结肠载膜、结肠腺瘤及结肠癌中依次递增，且与TNM分期、浸润深度、分化程度呈正相关，与研究相符，提示相对于正常豁膜，腺瘤和癌内的miR-21过表达代表了早期结肠癌发生事件。PTEN是miR-21的靶基因。，其产物是具有蛋白与脂质磷酸醋酶活性的双特异性磷酸醋酶，对磷脂酞肌醇x,4,5一三磷酸有特异性的3‘位脱磷酸活性，磷脂酞肌醇3一激酶(PI3K)/Akt信号通路的活性被PTEN从PIPS的3‘去除磷酸而将其转变成PI(4,5)P2而降解功能可使PTEN抑制PI3K/Akt信号转导途径yz}的功能。PI3K激活在质膜上产生第二信使三磷酸磷脂酞肌醇(PIP3),PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(phosphoinositidedependentkinase-1，PD-hI)结合，促使PDKl磷酸化Akt蛋白的Ser308导致Alct活化。Ak，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，能直接磷酸化多种转录因子，抑制凋亡基因的表达和增强抗凋亡基因的表达。活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad,Caspase9,NF-KB等，调节细胞的增殖、分化、凋亡。在正常状态下，NF-KB在胞质中与IKB结合，失去转录活性。Akt能通过磷酸化激活IKK(IKB激酶)，致IKB磷酸化、降解，与NF-KB分离，被释放的NF-KB转位到细胞核内诱导目的基因表达。Akt也能直接抑制caspase-9的活性，从而中断下游的信号。Ren等「3」研究发现miR-21抑制剂大大增加了人类恶性胶质瘤细胞的凋亡。本实验PTE1}T,Caspase-9表达及凋亡细胞百分率在正常载膜、结肠腺瘤及结肠癌中依次递减，NF-KB的表达在上述组织中依次递增，且miR-2I与NF-KB表达呈正相关，与PTEN,Caspase-9表达及凋亡细胞百分率呈负相关。笔者推测，结肠癌中mild-21高表达可能通过抑制PTEN进而上调NF-rcB、下调Caspase-9，抑制细胞凋亡参与肿瘤进展。参考文献王炎,宋贯霞,李琦. microRNA与大肠癌关系的研究进展[J].世界华人消化杂志,2011,(33):3426-3431.Zhang BG,Li JF,Yu BQ. MicroRNA-21 promotes tumor proliferation and invasion in gastric cancer by targeting PTEN[J].Oncology Reports,2012,(04):1019-1026.Ren Y,Zhou X,Mei M. MicroRNA-21 inhibitor sensitizes human glioblastoma cells U251 (PTEN-mutant) and LN229(PTEN-wild type) to taxol[J].BMC Cancer,2010.27.娄艳辉,杨兴升,王福玲. miR-21在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义[J].南方医科大学学报,2010,(03):608-610,613.梁旭东,杜焕社,史晓锋. Survivin、PTEN在胃癌中的表达及临床意义[J].中国医师杂志,2009,(07):701-703.doi:10.3760/cma.j.issn.1008-1372.2009.07.012.熊莉娜,熊枝繁,涂艳. CD147、NF-κB在食管鳞状细胞癌组织中的表达及意义[J].中国医师杂志,2010,(09):1171-1173.doi:10.3760/cma.j.issn.1008-1372.2010.09.005.陈卫昌,林茂松,黄俊星. 人结直肠癌微小核糖核酸的差异表达及其临床意义[J].世界华人消化杂志,2010,(30):3187-3194.Schetter AJ,Leung SY,Sohn JJ. MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colonadenocarcinoma[J].Journal of the American Medical Association,2008,(04):425-436.