血管内皮生长因子-C在胃癌细胞株和胃癌组织中的表达及其临床意义

　　作者：周慧聪,许培荣,张艳,李继昌　　作者单位：新乡医学院第一附属医院消化内科，河南 卫辉 郑州大学实验中心，河南 郑州 郑州大学基础医学院药理学教研室，河南 郑州 郑州大学第一附属医院消化内科,河南 郑州

　　【摘要】 目的 探讨血管内皮生长因子-C(VEGFC)在不同类型胃癌细胞株及组织中的表达及其与临床病理之间的关系。方法 应用反转录-聚合酶链反应(RTPCR)、Western blot分别检测VEGFC mRNA及其蛋白在胃癌细胞株中的表达，对53例胃癌及癌旁组织中VEGFC的表达采用免疫组织化学SP法染色检测，Ⅷ因子抗体及Ⅳ型胶原抗体双重免疫组织化学染色(SABC)法进行微淋巴管染色及微淋巴管计数。结果 在胃癌细胞株中均可检测到VEGFC mRNA及蛋白的表达，胃癌组织中，VEGFC蛋白的表达与淋巴结转移、病理分期有关(P<0.05);淋巴管密度与VEGFC蛋白的表达、淋巴结转移、病理分期有关(P<0.05)。结论 VEGFC表达与胃癌淋巴结转移密切相关，并有可能参与了胃癌淋巴管的形成。

　　【关键词】 胃癌,血管内皮生长因子-C,淋巴管,淋巴结转移

　　The role of vascular endothelial growth factorC and its expression in the gastric cancer tissues and cell lines ZHOU Huicong1，XU Peirong2，ZHANG Yang3，et al (1.Department of Gastroenterology ，the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Weihui 453100，China;2.Experimental Center of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China;3.Department of Pharmacology，College of Basic Medicine，Zhengzhou University,Zhengzhou 450052，China)

　　Abstract: Objective To study the relation between clinicopathological characteristic with the expression of vascular endothelial growth factor (VEGFC) in different type of gastric cancer cell lines.Methods The expression of VEGFC mRNA and protein in gastric carcinoma cell lines was examined by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) and Western blot respectively.Fifty and three cases′ expression of VEGFC in gastric cancer and in the paracancer tissue were detected by immunohistochemical methods.Double immunohistostaining with Ⅷ factor antibody and Ⅳ collagen antibody was used to stain and count the microlymphatic.Results The expression of VEGFC mRNA and its protein in all gastric carcinoma cell lines could be detected.Expression of VEGFC in gastric cancer associated with lymphatic metastasis and pathological staging (P<0.05).Lymphatic density also concerned with the expression of VEGFC,lymphatic metastasis and pathological staging(P<0.05).Conclusion VEGFC may play an important role in lymphatic metastasis of gastric cancer.， and could involve in formation of lymphangiogenesis.

　　Key words: gastric cancer; vascular endothelial growth factoC; lymphatic vessel;lymph node metastasis

　　胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国胃癌的发病率和死亡率居恶性肿瘤首位[13]。胃癌最主要的扩散形式是经淋巴道转移，淋巴结受累与否是肿瘤分期和直接针对引流区域淋巴结治疗的基础，也是影响其预后的重要指标。血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor，VEGFC)属于血管内皮生长因子家族，目前认为VEGFC是相对特异的淋巴管内皮生长因子，许多人类实体瘤细胞中VEGFC呈高表达与肿瘤细胞的增殖和转移关系密切。本研究主要通过反转录-聚合酶链反应(reverse-transcriptionpolymerasechainreaction，RTPCR) 、Westernblot杂交探讨不同分化胃癌细胞株中VEGFC的表达情况，并分析了53例不同肿瘤淋巴结转移(tumor node metastasis,TNM)分期的胃癌组织中VEGFC表达与淋巴结转移的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 选取郑州大学第一附属医院1998年至2003年手术切除后经病理诊断证实为胃癌的石蜡包埋组织标本53例，其中，男32例，女21例，年龄29～75岁。根据分化程度分为分化型(包括高分化腺癌和中分化腺癌)24例，差分化型(低分化腺癌、印戒细胞癌和未分化癌)29例;早期胃癌组14例，中晚期胃癌组39例;无淋巴结转移组20例，有淋巴结转移组33例。病理诊断由2位病理学专家认定。SGC7901、BGC823胃癌细胞株由郑州大学第一附属医院消化内科实验室保存。

　　1.2 试剂 Trizol试剂购自Invitrogen公司，禽成髓细胞瘤病毒反转录酶(adeno murine virus,AMV)第一链cDNA合成试剂盒和预染蛋白marker购自上海Sangon公司，PCR扩增试剂盒和DNA Marker为TaKaRa公司产品。兔抗人VEGFC抗体由美国Santa CRUZ 公司提供，兔抗人Ⅷ因子抗体、鼠抗人Ⅳ型胶原抗体、SP试剂盒均购于北京中山公司，酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(strept avidinbiotin comeplex，SABC)双染试剂盒购于武汉博士德公司。

　　1.3 细胞培养 细胞常规培养于RPMI1640(rothwell park memorial institute medium)培养基，37℃，体积分数5% CO2饱和湿度的恒温密闭培养箱中传代培养;每2～3 d用2.5 g•L-1胰酶消化传代培养。

　　1.4 WesternBlot杂交 提取不同分化细胞株的总蛋白，以小牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)检测定量，总蛋白电泳于质量分数10%聚丙烯酰胺凝胶后，电转移于硝酸纤维素膜，封闭液中4 ℃过夜，1200 VEGFC一抗，室温1 h，洗膜3次，结合辣根过氧化物酶标记的二抗1 h，洗膜3次，ECL发光。同时检测各细胞株中的βactin 表达情况，以VEGFC/βactin 来反映VEGFC蛋白的相对含量。

　　1.5 反转录-聚合酶链反应 胃癌细胞的总RNA经AMV反转录合成cDNA第1链，对目的基因VEGFC和内参基因B肌动蛋白 (Bactin)同时扩增，25 μL体系中包括150 μmol•L-1 dNTP、1.5 mmol•L-1 MgCl2、50 μmol•L-1上下游引物和2.5 U TaqDNA聚合酶。95℃预变性10 min后进入循环，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，28循环，72 ℃延伸10 min。同时检测各细胞株中的βactin 表达情况，以VEGFC/βactin 来反映VEGFC mRNA的相对含量。

　　1.6 免疫组织化学染色 将厚5 μm连续石蜡切片脱蜡至水(细胞爬片用丙酮固定15 min)，进行HE染色，免疫组织化学单染和免疫组织化学双重染色。所用一抗VEGFC工作浓度为1100，采用2.5 g•L-1胰蛋白酶消化进行抗原修复，修复时间15 min，染色方法按链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法试剂盒说明书步骤进行，经3，3′-二氨基联苯胺 (3，3′diaminobenzidine，DAB)染色后，苏木素对比染色，中性树胶封片，磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。免疫组织化学双重染色按SABC双染试剂盒说明书进行，抗原修复均为2.5 g•L-1胰蛋白酶消化修复，时间为8～10 min。

　　1.7 结果判断 VEGFC的判定以肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，以定位明确，染色明显，20%以上细胞染色的组织切片视为VEGFC阳性，而染色弱或完全不染色者为VEGFC阴性。Ⅷ因子抗体及Ⅳ型胶原抗体双重免疫组织化学染色的同一张切片，光镜下可见毛细淋巴管仅内皮细胞着蓝褐色，而毛细血管则呈现内层蓝褐色外层红色的双层着色。

　　淋巴管密度的计数方法：先于低倍光镜(100倍)下确定3个淋巴管着色最密集的区域，然后在200倍视野下计数微淋巴管，取3个视野的均值作为微淋巴管密度(microlymphatic vescular density，MLVD)。

　　1.8 统计学处理 分析应用SPSS 10.0统计分析软件，统计方法采用χ2检验、独立样本t检验，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 不同胃癌细胞株中Western Blot 的结果 2株细胞均有VEGFC表达，BGC823、SGC7901中VEGFC的相对含量分别是0.79±0.06、0.68±0.02，2组之间差异具有显著性(P<0.05)。SGC7901表达水平最高(图1)。

　　2.2 不同胃癌细胞株中VEGFC mRNA的表达 RTPCR结果显示，2株细胞均有VEGFC mRNA表达，BGC823、SGC7901中VEGFC的相对含量分别是0.45±0.02、0.64±0.04，2组之间差异具有显著性(P<0.05)。SGC7901表达水平最高(图2)。

　　2.3 不同胃癌细胞株中VEGFC免疫组织化学染色 细胞爬片固定后，免疫组织化学染色显示，2株胃癌细胞株的胞浆均有棕色颗粒，呈弥散分布，说明均有VEGFC蛋白表达，但SGC7901细胞着色较深，表达较强(见图3、图4)。

　　2.4 VEGFC蛋白在胃癌组织中的表达 53例胃癌组织VEGFC阳性表达者18例(34%)，阳性产物为棕黄色颗粒，位于胃癌细胞胞质内，VEGFC在胃癌间质和癌旁正常组织无表达。

　　2.5 免疫组织化学双重染色结果 光镜下可见毛细淋巴管仅内皮细胞着蓝褐色且形状不规则，管壁相对较薄，管腔较大;而毛细血管则呈现内层蓝褐色外层红色的双重着色，管腔厚，管腔较小(图5)。

　　2.6 VEGFC表达与各临床病理指标间的关系 VEGFC在分化型腺癌中的表达率为25.0%(6/24)，差分化型腺癌的表达率为41.4%(12/29)，二者比较无显著差异 (P>0.05);7.1%(1/14)的早期胃癌有VEGFC阳性表达，43.6%(17/39)的进展期胃癌有VEGFC阳性表达，二者比较有显著差异(P<0.05);33例伴淋巴结转移的胃癌组织中，VEGFC表达率为45.5%(15/33)，20例不伴淋巴结转移者中VEGFC表达率为15.0%(3/20)，二者比较有显著差异(P<0.05)。VEGFC的表达与肿瘤的大小、年龄、性别无关。

　　2.7 淋巴管密度与VEGFC表达及临床病理特征的关系 53例胃癌组织淋巴管每例为9.35～33.46个，平均(22.00±5.85)个，18例VEGFC表达阳性组淋巴管的密度为24.30±5.85，35例VEGFC蛋白表达阴性组淋巴管的密度为20.8±5.54，2组之间差异有显著性(P<0.05),14例早期胃癌组淋巴管的密度为18.10±4.81，39例进展期胃癌组淋巴管的密度为23.40±5.61，2组之间差异有显著性(P<0.05);20例无转移组淋巴管的密度为17.90±4.49，33例转移组淋巴管的密度为24.50±5.20，2组之间差异有显著性(P<0.05)。

　　3 讨论

　　VEGF最早从肿瘤细胞分泌液中获得[4],大量研究发现VEGF在恶性肿瘤中表达升高[5],血管内皮VEGF不但促进肿瘤血管的形成,也促进肿瘤的侵袭和转移,在实体肿瘤生长、浸润、转移过程中起至关重要作用,并且与肿瘤病理分级、疾病分级及预后密切相关[67]。VEGF可刺激血管内皮细胞增殖,促进血管形成,并可诱导淋巴管生成和扩张,使肿瘤细胞进入淋巴管和淋巴结而转移[8]。

　　VEGFC属于血管内皮生长因子家族，是1996年Joukov等[9]利用受体亲和色谱法从人类前列腺癌细胞株PC3的cDNA文库中提取并分离出VEGF/PDGF家族的一个新成员。肿瘤细胞产生的VEGFC可通过VEGFC/VEGFR3自分泌途径，引起VEGFR3的激活，诱导淋巴管内皮细胞的增殖，形成新生的淋巴管，肿瘤细胞产生的VEGFC能通过激活表达在淋巴管内皮细胞上的VEGFR3，诱导间质中淋巴管生成，可使肿瘤细胞与扩增的淋巴管接触并侵入淋巴管，引起淋巴道转移[10]。Jeltsch等[2]首次报道VEGFC转基因小鼠中，VEGFC过表达能够特异性诱导淋巴内皮的增殖和淋巴管的增生。临床病理研究显示在胃癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌及甲状腺癌等肿瘤中，VEGFC表达与淋巴管侵犯和淋巴结转移有关[1115]。Amioka等[16]对浸润至黏膜下层的早期胃癌的研究发现VEGFC表达阳性患者肿瘤细胞淋巴管侵袭及淋巴结转移较VEGFC阴性患者明显增多。本研究对有不同背景的2株胃癌细胞株进行检测，结果也显示，伴有淋巴结转移的中分化胃癌细胞株SGC7901中VEGFCmRNA和蛋白的表达均高于低分化胃癌细胞株BGC823,并在胃癌组织中用免疫组织化学方法证实VEGFC可选择性地表达在部分胃癌细胞，阳性表达率为34%，高分化胃癌组织中VEGFC的表达位于癌巢的周边、较弱，而低分化癌组织中，则弥漫、较强，但 VEGFC的表达与肿瘤的分化程度无关，而与病理分期及淋巴结转移密切相关。

　　本实验用双重免疫组织化学的方法区分毛细淋巴管和毛细血管，并计算淋巴管的密度。53例胃癌组织中，VEGFC高表达的胃癌组织中，淋巴管密度明显增高，推测 VEGFC可能参与了促进胃癌淋巴管的生长，同时发现淋巴管密度与淋巴转移呈正相关。有淋巴结转移的病例，淋巴管密度明显增高。实验发现，癌内淋巴管呈条索状，癌旁组织内淋巴管呈腔状，更有利于肿瘤的侵袭。

　　淋巴结转移的发生是一个多因素参与的复杂过程和多因素协同作用的结果，对其分子作用机制深入研究和阐明，将为抗肿瘤转移治疗开辟新的方向。

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