食管癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞检测及其临床意义

　　作者：付白清,吴朝阳,许亚平,王法春,陈巧云　　作者单位：江苏大学附属人民医院 1.消化科; 2.血液科;3.中心实验室，江苏 镇江

　　【摘要】目的： 通过检测食管癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的变化，观察其与临床及病理征之间的关系，探讨其临床意义。方法： 采用流式细胞术检测30例食管癌患者及16例健康志愿者外周血单个核细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞的比例;收集食管癌患者的临床及病理资料，分析研究Treg细胞变化与临床及病理特征之间的关系。结果： 流式细胞术检测显示食管癌患者外周血PBMC中CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞的比例为(3.72±1.39)%，高于对照组(1.15±0.36)%， P<0.01;食癌管患者外周血中Treg细胞比例与患者的年龄、性别、肿瘤的位置无明显相关性(P>0.05),而与淋巴结转移情况及TNM分期有明显的相关性(P<0.05)。结论： CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞可能在食管癌免疫耐受中发挥重要作用，检测其比例对于判断食管癌的病期及预后有一定价值。

　　【关键词】 调节性T细胞,食管癌,流式细胞术

　　[Abstract]Objective: To find out the change of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells in peripheral blood of esophageal cancer patients, the relationship between clinical data and pcorholozical characteristics, and to study their clinical significance.Methods： Flow cytometry was used to analyze the proportion of CD4+CD25+Foxp3+T cells/CD4+T cells in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from 30 patients with esophageal cancer and 16 healthy peoples. Clinical data and pathological characteristics of cancer patients were collected, and ttest was used to analyze the relationship between the proportion of Treg cells in PBMC and clinical data and pathological characteristics. Results： The proportion of CD4+CD25+Foxp3+T cells/CD4+T cells in PBMC from esophageal cancer patients was significantly higher than that of controls(P<0.01). The proportion of Treg cells in PBMC has no significant difference with sex, age, location of tumor, category of pathology and the infiltrating depth of tumor(P>0.05). The proportion of Treg cells in PBMC of cancer patients was correlated significantly with lymph node metastasis and stages of TNM(P<0.05). Conclusion： Treg may have an important role in immune tolerance of esophageal cancer.Detection of Treg cells have clinically value on evaluation of development and prognosis of esophageal cancer.

　　[Key words] regulatory T cell; esophageal cancer; flow cytometry

　　调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg)是近年来确定的一类具有免疫调节功能的T细胞亚群,在维持机体免疫自稳、调控免疫应答方面起重要作用。Foxp3是其分化发育的关键基因[ 1 ]。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在肿瘤免疫耐受机制中发挥的作用近来备受瞩目,多种肿瘤患者机体内外周血及肿瘤局部均有调节性T细胞的比例增高。我们检测了30例食管癌患者的外周血中细胞表型CD4+CD25+及其特异性标志Foxp3的变化,并将这些改变与临床资料进行比较分析,探讨Treg细胞在肿瘤发展及免疫应答中的调控作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　食管癌患者30例, 来源于2007年10月～12月在我院胸外科的住院患者,男16例, 女14例,年龄33～81岁,平(60.60±11.83) 岁。健康志愿者16例做对照, 其中男11例, 女5例, 年龄33～68岁, 平均(49.81±10.76) 岁。肿瘤患者术前未进行放疗和化疗，且排除糖尿病及自身免疫系统疾病。术后病理检查发现,肿瘤位于上段3例,中段18例,下段9例;肿瘤TNM分期： Ⅰ+Ⅱ期10例, Ⅲ+Ⅳ期20例;肿瘤淋巴转移阳性者19例,阴性11例。

　　1.2 主要试剂

　　荧光抗体鼠抗人CD4FITC,CD25APC,Foxp3PE单克隆抗体，阴性对照鼠抗人IgG2aFITC, IgG2aAPC,IgG2aPE均购自eBioscience公司。

　　1.3 方法

　　抽取静脉血2 ml, EDTA抗凝,以淋巴细胞分离液常规分离单个核细胞(PBMC)，计数细胞后调整细胞浓度至1×106/ml。流式细胞仪检测，以CD4设门，分析门内CD4+CD25+Foxp3+细胞亚群，每份标本计数105个细胞，结果以CD4+CD25+Foxp3+细胞占CD4+细胞的比例表示。

　　1.4 统计学处理

　　应用SPSS12.0软件处理实验结果，计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞流式细胞仪检测结果

　　流式细胞仪检测发现,食管癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg占总CD4+T细胞的比例为(3.72±1.39)%,健康对照组为(1.15±0.36)%。食管癌患者外周血Treg细胞较健康对照组显著增高(P<0.01)，见图1。

　　2.2 食管癌患者外周血中Treg细胞占CD4+T细胞的比例与病理因素的关系

　　由表1可以看出，食管癌患者外周血Treg细胞占CD4+T细胞的比例与患者的年龄、性别、肿瘤的位置之间无明显相关性(P>0.05)，而与食管癌淋巴结的转移及TNM分期有一定的相关性(P<0.05)。淋巴结有转移者，外周血Treg细胞的比例明显高于无淋巴结转移者;在Ⅲ期、Ⅳ期食管癌患者，外周血Treg的比例明显高于Ⅰ期和Ⅱ期，TNM分期晚，Treg细胞增多明显。表1 食管癌外周血Treg细胞的比例与临床病理特征的关系(略)

　　3 讨论

　　1995年Sakaguchi首次报道在正常人和小鼠的外周血及脾脏组织的CD4+T 细胞中约有5%～10%的细胞持续高表达CD25分子(IL2受体α链),同时这一亚群细胞是CD45RB分子低表达的。CD4+CD25+调节性T细胞在维持自身免疫耐受中起重要作用，近来的研究发现Treg细胞与抑制性T细胞具有许多类似的功能特征,能明显抑制效应性T细胞的增殖[ 2 ]，它与肿瘤免疫逃逸有密切的关系。卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌等多种肿瘤患者的外周血及肿瘤局部Treg细胞比例增加[ 3，4 ]。

　　Foxp3是叉头样转录因子家族的成员,目前在mRNA和蛋白质水平已证实Foxp3仅在CD4+CD25+调节性T细胞上特异性表达,且在CD4+CD25+调节性T细胞的发育和功能上是必需的[ 1， 5 ]，故可作为Treg细胞的特异性标志。

　　生理状态下，机体内Treg细胞的免疫学意义在于维持机体免疫稳态，故正常人外周血中能够检测到Treg细胞,其在CD4+T细胞中比例可在一定程度上反映机体的免疫状况。但是到目前为止，对于健康成人外周血的Treg细胞水平尚没有大规模普查,各家报道的比值不尽相同。Dieckmann等[ 6 ]报道为2.8%～17.2%, Ichihara 等[ 7 ] 报道为7.2%,Jonuleit等[ 8 ]报道为0.7%～5.5%。我们检测了16例健康志愿者，且以CD4+CD25+Foxp3+T细胞为Treg细胞，结果为0.61%～1.80%，与上述报道有差异。可能因为上述研究以CD4+CD25+细胞为Treg细胞，而我们以CD4+CD25+Foxp3+细胞为Treg细胞，能更特异更准确反映食管癌患者外周血中调节性T细胞的状态。

　　本研究结果显示，食管癌患者外周血中Treg细胞占CD4+T细胞的比例比对照组明显增高，推测在食管癌发展过程中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞可能起着重要作用。同时结合临床资料，我们发现外周血中Treg细胞比例的增高与患者年龄、性别、肿瘤部位无关，而与肿瘤的TNM分期及淋巴结的转移情况有明显的相关性，食管癌淋巴结有转移者，其外周血Treg与无转移者相比有显著增高，TNM分期在Ⅲ、Ⅳ期者，其外周血Treg细胞与Ⅰ、Ⅱ期者相比亦有明显增高，提示食管癌患者外周血Treg细胞的增高是食管癌的后期事件，在肿瘤发生的早期，对全身免疫系统影响不明显，随着癌肿的不断进展，影响到全身，从而导致Treg细胞的不断增加。因而我们认为食管癌患者外周血Treg细胞的变化可能在病情及预后判断方面有一定的价值。

　　【参考文献】

　　[1]Hori S,Nomura T,Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the Transcription factor Foxp3[J].Science,2003,299(5609):1057-1061.

　　[2]马洁,王胜军，胡嘉波，等.小鼠CD4+CD25+调节性T细胞分离和鉴定[J].江苏大学学报：医学版，2005,15(2):117-119.

　　[3]Liyanage UK,Moore TT,Joo HG,etal.Prevalence of regulatoryTcells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma[J].J Immunol,2002;169(5): 2756-2761.

　　[4]Wolf AM, Wolf D, Steurer M, et al. Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients[J]. Clin Cancer Res,2003,9(2):606-612.

　　[5]Khattri R,Cox T,Yasayko SA,et al. An essential role for scurfin in CD4+CD25+T regulatory cells[J].Nat Immunol,2003,4(4):337-342.

　　[6]Dieckmann D, Plottner H, Berchtold S, et al. Ex vivo isolation and characterization of CD4+CD25+T cells with regulatory properties from human blood[J].J Exp Med, 2001,193(11):1303-1310.

　　[7]Ichihara F, Kono K, Takahash IA, et al. Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood and tumorinfiltrating lymphocytes in patients with gastric and esophageal cancers[J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(12):4404-4408.

　　[8]Jonuleit H, Schmitt E, Stassen M, et al. Identification and functional characterization of human CD4(+)CD25(+)T cells with regulatory properties isolated from peripheral blood [J]. J Exp Med,2001,193(11):1285-1294.