定位性兔髂动脉粥样硬化模型的建立

介入性治疗，如经皮腔内血管成形术或支架置入等，已成为冠心病治疗的有效手段之一，但其再狭窄率可高达20%~50%左右，严重地限制其临床远期疗效。为解决这一难题，探讨再狭窄发生的机制和预防措施，必须首先建立粥样硬化狭窄模型[1]，在此基础上进行球囊扩张术，以模拟介入性治疗，可为其再狭窄的研究提供有利的基础。

1资料与方法

1.1 动物及其分组：购自福建省药检所的纯种新西兰大白兔48只，雌雄不限，体重2.5 ~3.5 kg ，5~6月龄，每只单笼饲养于福建省立医院动物实验室内，随机分为两组：对照组6只，喂养普通混合颗粒饲料(购自福建省科洪技术有限公司)，100 g/d;模型组42只，喂养高脂饲料(含1%胆固醇，6%猪油，93%普通饲料，购自上海松江车墩镇实验动物良种场)，10 0 g/d,自由饮水。

1.2 双侧髂动脉内膜剥脱术：模型组动物在高脂饲料饲养7~10 d后，行双侧髂动脉内膜剥脱术，3%戊巴比妥钠1 ml/kg经耳缘静脉注射麻醉，固定四肢及头部，双后肢内侧剪毛，常规消毒皮肤，沿股动脉走行方向纵行切开皮肤，游离出股(浅)动脉，逆行插入球囊导管(导管直径1.2 mm，球囊直径2.5 mm，球囊长度20 mm，Cordis公司产品)，插入深度为6 cm，连接手推式压力注射器，向球囊内注入肝素生理盐水，使球囊膨胀，并维持压力 4 atm(406 kpa)，缓慢回拉导管至切口处，抽空球囊内液体，使压力降至为零。再将导管送入重复上述过程3次，退出导管，结扎动脉，缝合皮肤。以同样方法剥脱对侧髂动脉内皮。术后每只给予青霉素80万U，连续3 d。对照组仅分离出相应动脉未给予结扎及剥脱。继续上述各自饲料喂养。

1.3 双侧髂动脉造影术。在高脂饲料喂养8周后行髂动脉造影术。3%戊巴比妥钠从兔耳缘静脉注射麻醉后，颈前正中术野剪毛，常规消毒皮肤，沿正中纵行切开皮肤及皮下组织，钝性分离右颈总动脉上段，逆行插入0.36 mm的导引钢丝，在1 000 mA血管数字减影机X线透视下，送至腹主动脉下段，顺导引钢丝引入4F造影导管(Cordis公司产品)至腹降主动脉分叉上方，撤出导引钢丝，经导管注入肝素300 U后， 快速注入38%泛影葡胺2~3 ml，同时，造影时在家兔脊柱旁放置铁丝1 cm，以纠正拍片时的放大作用。

1.4 观察指标：所有动物在进入动物实验室后，进食普通饲料后1周，称体重，清晨空腹自耳中央动脉抽血后，给予相应饲料喂养，在双侧髂动脉内皮剥脱术后7周，复查血清或血浆指标。 1.4.1 血脂的测定：清晨空腹取血约2 ml于10 ml离心管中，室温静置片刻后1 500转/min，离心2 0 min， 取上清液，采用美国贝克曼公司生产的SRX型全自动生化分析仪测定血清总胆固醇( TC) 、三酰甘油(TG)，高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。 1.4.2 采用血管数字减影电影放映测量髂动脉的狭窄部位及其程度，由两位有经验的医师进行盲式测量。 1.4.3 原位固定及取材：在髂动脉造影术后，随机取模型组动物6只以及对照组动物，即刻分离主动脉，插管以生理盐水、4%多聚甲醛溶液灌注固定后分离双侧髂动脉，以造影片为参照，切取相应狭窄部位血管，置10%中性福尔马林中继续固定24 h，并随机切除部分髂动脉标本，送福建医科大学电镜室及福建省分析测试中心分别进行透射电镜及扫描电镜检查。 1.4.4 组织处理：根据造影片选取狭窄髂动脉血管0.5~1.0 cm，石蜡包埋，间断均匀切片5~ 10张，切片厚度5um，分别制作苏木素伊红(HE)染色，弹力纤维染色(醛品红法，弹力纤维呈深紫色)，观察形态学变化。

1.5 统计学处理：实验结果数值采用均数±标准差(x〖TX-*3〗±s)表示。两两比较采用配对或非配对t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。数据处理使用SPSS 19.0 统计软件。

2结果

2.1 血脂测定结果：见表1。可见实验前两组间血脂水平比较差异无统计学意义(P>0.05 )，8周后模型组三酰甘油(TG)，总胆固醇 (TC) 及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)明显高于正常组(P﹤0.01)，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)则明显低于正常组(P﹤0.01)。

2.2 动脉造影结果：正常组兔双侧髂动脉管壁光滑，未见明显狭窄或中断。模型组，可见双侧髂动脉管壁不同程度的狭窄，以至完全阻塞、中断，自15%～100%不等，平均狭窄程度约(61.47±28.1)%，多为向心性狭窄，管腔均匀变细，也可见偏心性狭窄及不规则狭窄，可呈局限性或弥漫性狭窄改变，多分布于30%～50%以及75%～100%之间。见图1。 〖TP112909.tif，+50mm。80mm，BP#〗〖TS(〗〖HT6SS〗A显示对照组双侧髂动脉光滑，未见明显狭窄或中断，双侧股浅动脉光滑。B 显示模型组左侧髂外动脉完全阻塞，右侧髂外动脉狭窄程度约 56%，右侧股浅动脉中远段未显影，双侧髂内动脉增粗，远端侧支形成，尤其左侧〖JZ〗〖WT6HZ〗〖ST6HZ〗〖HT6H〗图1〖HTSS〗〖STBZ〗〖WTBZ〗动脉造影结果〖TS) 〗〖HT5”SS 〗

2.3 病理学改变：①肉眼观察：打开腹腔，可见模型组髂动脉周围有大量脂质沉积，动脉管壁呈黄白色，增粗、变硬，而正常组未见明显异常，略带微红色;②光镜观察：正常兔髂动脉内膜完整，连接紧密的内皮细胞下衬托波浪状内弹力膜，中膜由10多层排列整齐的平滑肌细胞组成，细胞核多呈梭形，内、外弹力膜完整，模型组髂动脉管壁均匀或不均匀地明显增厚，导致管腔向心或偏心性缩小。可见内皮细胞再生，较稀疏，形状大小不一，核偏大。内膜增厚，内有大量的脂质和泡沫细胞，胶原纤维以及平滑肌细胞，泡沫细胞胞浆透明呈网状，平滑肌细胞核形状不一，可呈圆形或梭形，排列紊乱，严重者可见典型的粥样斑块，其表层为纤维结缔组织，其中可有平滑肌纤维，斑块的深部为无细胞的不定形物质，其中含有胆固醇结晶，坏死组织和少量纤维素。细胞排列紊乱，内弹力膜不同程度断裂，外弹力膜尚完整; ③透射电镜观察：正常内皮细胞呈扁平状，细胞间连接完整。内弹力膜明显，位于内皮下，较厚，密度较低。中膜平滑肌细胞平行多层排列，胞浆内肌丝丰富，密体、密斑、微泡多见，粗面内质网少见，胞质较多，呈分枝状，核呈梭状，为收缩型平滑肌细胞。胶原纤维及弹力纤维组织较少，散在分布，外弹力膜明显。模型组可见再生血管内皮细胞呈扁平状、立方形或不规则形状，核椭圆或圆形或扭曲，常染色质丰富，胞浆内粗面内质网较多见，有的内皮细胞胞浆可见大小不等空泡或明显肿胀而增大或脱落，内膜裸露，部分区域细胞间连接尚完整，在某些区域可见内皮细胞表面有丝状突起或短突起。内弹力膜变薄或断裂，内膜增厚，其内含较多的泡沫细胞和平滑肌细胞，泡沫细胞内脂滴丰富，大小不等，溶酶体较易见，核呈圆形或椭圆形，染色质呈小块状分布于核膜下。部分泡沫细胞内可见较多肌丝及密斑、密体，提示其来源于平滑肌细胞。内膜层多数平滑肌细胞形态发生改变，核常呈椭圆形，细胞外形不规则，常有指状突起，质膜下斑块状密斑明显、密体也可见，除含少量肌丝外，粗面内质网明显增多，高尔基体较多见，溶酶体少见，提示其为合成型平滑肌细胞。胶原纤维明显增多，其间有少量的弹力纤维，未见明显炎症细胞浸润。外膜外平滑肌细胞体积较小，脂滴含量较少;④扫描电镜观察(见图2)：正常对照组内皮细胞核呈椭圆形隆起，表面呈现波浪状起伏，细胞界限隐约可见或不清，排列紧密，细胞纵轴与血管纵轴平行排列，未见明显血小板或白细胞黏附其表面(图2A)。模型组内皮细胞排列紊乱，疏密不均，形态不一，有的呈扁平状或隆起呈立方形或梭状，细胞纵轴方向不一或与血管的纵轴方向不一致甚至垂直(图2B)。有些区域内皮细胞肿胀界限尚可见，有些细胞表面有孔，有些区域可见腔下纤维组织(图2C)。 A对照组内皮细胞核呈椭圆形隆起，表面呈现波浪状起伏，细胞纵轴与血管纵轴平 行排列(×600);B模型组内皮细胞排列紊乱，疏密不均，形态不一，细胞纵轴方向不一(×600);C模型组内膜内皮细胞肿胀部分区域可见腔下纤维组织(×1 500)〖JZ〗〖WT6HZ〗〖ST6HZ〗〖HT6H〗图2扫描电镜结果

3讨论

1914年Anitschkow等用家兔成功地复制了兔的动脉粥样硬化模型，但因其病变主要位于主动脉弓和胸主动脉，其管腔较粗，在短期内尚难以形成较为严重的狭窄，不便于再狭窄的研究。兔髂动脉管腔直径与人冠状动脉相似，但经高脂饮食，不易于自发形成明显粥样硬化。若靠加大胆固醇饲养量和延长喂养时间，又容易造成多脏器脂质沉积，尤其是肝硬化而死亡[1]。为此，人们进行各种形式损伤动脉内膜的研究。Block等[2]采用内膜剥脱及高胆固醇饮食，成功地复制了定位性动脉粥样硬化模型，并进行球囊扩张，认为其病理形态学的改变与人冠脉病变大致相似[3]。虽然在本实验中内皮细胞剥脱的长度较文献报道短[1-2]，但也成功地复制了定位性动脉粥样硬化模型，双侧髂动脉可见不同程度的狭窄，多在30%以上，分布在30%~50%及75%~100%之间，与文献报道[1]略有差别，可进一步行球囊扩张术的研究。本实验的病理研究表明，所诱导产生的斑块与人类的斑块其成分有一定相似性，包括斑块的纤维帽、脂核等[4]。病理结果说明早期的斑块主要为泡沫细胞，而纤维斑块期脂核形成后， 其中心主要成分为胆固醇和含固体结晶或液晶态的胆固醇酯，与文献报道相似[3-5]。而且本实验经扫描电镜及透射电镜证实局部还可见内皮细胞再生(也经免疫组化CD31标记证实)，可能与本实验内皮细胞剥脱的长度较短有关，有利于进一步研究内皮细胞在球囊扩张术后的动态变化，有关扫描电镜了解管腔内内皮细胞生长情况，国内外相关文献极少见报道。 经高脂饮食后，可见血中总胆固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白胆固醇均明显增高，而高密度脂蛋白胆固醇明显降低，与文献报道相似[5-6]，有利于脂质从血液进入动脉壁内，妨碍了脂类从动脉壁移出，致使大量脂质(胆固醇酯等)在血管壁内沉积，诱发单核巨噬细胞、平滑肌细胞等迁移、浸润，最终形成泡沫细胞。同时，它们还释放各种细胞因子和生长因子，致使细胞外基质合成增加，导致血管壁纤维化等病变[6]。高胆固醇血症可导致脂质过氧化物、氧化型低密度脂蛋白(OXLDL)在动脉管壁中升高，刺激内皮细胞表达血管细胞黏附因子-1，刺激血管内皮细胞、泡沫细胞以及平滑肌细胞表达基质金属蛋白酶-9，进而促进血管重塑，增加斑块的易损性等[5，7-8]，它们在动脉粥样硬化形成过程中起重要作用。本模型在高胆固醇饮食的同时，进行内膜剥脱，严重地导致局部内皮细胞的损伤、脱落、丢失，从而暴露内皮下血管壁组织，有利于脂质侵入血管壁，同时内皮细胞对平滑肌细胞的抑制作用也削弱，有利于平滑肌细胞有丝分裂、增殖、迁移、合成细胞外基质等，高脂饮食也协同促进细胞外基质的合成，有利于局部粥样硬化的形成[6，9]。 但应该指出，尽管经血管造影及病理形态学已证实经内膜剥脱及高胆固醇饮食可成功地建立动脉粥样硬化模型，与人体病变大致相似，但其泡沫细胞相对较多，而且兔髂动脉为弹力型动脉，经扩张后可伸展，而与人类病变以纤维增生为主，冠脉为肌型动脉，经扩张后易产生撕裂不相符[10]。但本实验方法建立的动脉粥样硬化狭窄模型有以下特点：选用中国多见、容易饲养的新西兰白兔;符合动脉粥样硬化形成的损伤及脂质浸润学说，模拟了人类动脉粥样硬化的形成过程，还最大限度地体现了临床上内皮损伤和血栓形成、脂质沉积等形成粥样硬化斑块狭窄的病理特征;造模时间短，内皮剥脱后7周即可成型，所形成的狭窄范围局限，且狭窄程度一致，相对易于复制粥样硬化模型，价格相对便宜，容易操作，来源方便，而且其球囊扩张后所导致的病理改变，如内膜撕裂、斑块破裂、出现假腔或夹层等，与人冠脉腔内血管成形术后不久死亡者病理改变相似，且较腹主动脉模型更接近人类冠状动脉，尽管其较人类冠脉病变损伤后愈合过程快，但目前已被较广泛地应用于PTCA或支架术后再狭窄的机制研究[2-5，10]。 总之，采用高脂饲料与内膜损伤结合的方式来制作定位性髂动脉粥样硬化斑块的模型是可行的、实用的，可以为进一步研究再狭窄提供一个较好动物模型平台。 (本文电镜方面承蒙福建医科大学电子显微镜室陈振斌教授给予无私的支持和帮助，特此致谢。)

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4Nakazawa G,Nakano M,Otsuka F. Evaluation of olymer-based comparator drug-eluting stents using a rabbit model of iliac artery atherosclerosis[J].Circ cardiovasc interv,2011,(01):38.

5袁吉祥,姚成立. 牛磺酸拮抗高脂血症致兔动脉粥样硬化的实验研究[J].吉林医学,2010,(31):5498.

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