鸟苷酰环化酶C小干扰RNA对胃癌细胞生长的影响

　　作者：王鹏飞,张洁,毛振彪　　作者单位：南通大学附属医院消化内科，南通

　　【摘要】 目的：研究靶向鸟苷酰环化酶C(Guanylyl cyclase C，GC-C)的小干扰RNA(siRNA)对人胃癌SGC-7901细胞体外生长能力的影响。方法：利用pSilencerTM4.1-CMV neo通过 siRNA表达载体法制备GC-C siRNA。将GC-C siRNA转染胃癌SGC-7901细胞，采用RT-PCR和间接免疫荧光观察转染前后胃癌细胞GC-C基因的表达变化，黏附实验观察转染前后胃癌细胞黏附能力。结果：构建的GC-C siRNA测序鉴定与设计完全相符。GC-C siRNA转染胃癌SGC-7901细胞后，明显抑制GC-C基因的表达。转染后，GC-C mRNA和蛋白表达分别抑制了66.7%和75.8%，细胞黏附能力较对照组减弱(P<0.05)。结论：靶向GC-C的siRNA可明显下调靶基因GC-C的表达，在体外抑制胃癌SGC-7901细胞的黏附，提示GC-C基因与胃癌的发生、发展有密切的关系。

　　【关键词】 胃癌细胞,鸟苷酰环化酶C,小干扰RNA;黏附

　　[Abstract] Objective: To investigate the effect of synthetic GC-C short interfering RNA(siRNA)on growth of human gastric cancer line SGC-7901cells in vitro. Methods: Based on pSilencerTM4.1-CMV neo vector, GC-C siRNA was constructed. siRNA targeting GC-C mRNA was transfected into SGC-7901 cells, and GC-C expression was determined by RT-PCR and indirect immunofluorescence. The ability of cell adhesion was examined by adhesion assay. Results: A pair of siRNA sequences completely matched with target sequences. After transfected with GC-C siRNA, the expression of GC-C mRNA and protein in SGC-7901 cells were reduced by 66.7% and 75.8%, respectively. And the ability of cell adhesion was suppressed in vitro(P<0.05). Conclusions: SiRNA directed against GC-C can significantly suppress adhesion of SGC-7901 cells, which indicated that GC-C may play an important role in the process of gastric cancer’s developing and metastasis.

　　[Key words] Gastric cancer cell;Guanylyl cyclase-C;Small interferencing RNA;Adhesion

　　鸟苷酰环化酶C(guanylyl cyclase-C，GC-C)是鸟苷酰环化酶家族成员之一[1]，不在正常胃表达，从肠上皮化生→异型增生→胃癌过程中，胃黏膜出现GC-C异位表达。因此有研究认为GC-C可作为肠上皮化生、异型增生和胃腺癌分子标志物[2]。RNA干扰[3-5] (RNA interference，RNAi)是近年来发展的一种阻抑基因表达的新方法。本研究利用pSilencerTM4.1-CMV neo制备GC-C siRNA，再利用RNAi技术体外抑制人胃癌SGC -7901细胞GC-C表达并观察其对肿瘤细胞生长的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株及培养液 人胃癌细胞株SGC-7901购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，RPMI 1640细胞培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自Hyclone公司。

　　1.1.2 主要试剂和材料 pSilencerTM4.1-CMV neo Kit 购自美国Ambion公司;Lipofectamine 2000、Opti-MEMI培养基购自美国Invitrogen公司;山羊抗GC-C多克隆抗体(编号SC-34428)购自美国Santa Cruz公司;FITC标记的兔抗山羊IgG购自美国Jackson Lab公司;Hochest(H3342)购自美国Sigma公司;纤维连接蛋白(美国BD Pharmigen公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 通过pSilencerTM 4.1-CMV neo载体GC-C-siRNA构建与鉴定 根据人的GC-C mRNA序列(NM 004963)，按Tuschl设计原则[6] ，由Ambion siRNA在线设计系统搜索，选出符合条件针对GC-C 21nt siRNA：5'-AATCAAGATGCCT CGTTATTG-3'。根据pSilencerTM4.1-CMV neo说明书组成长度为55 nt的寡核苷酸链。siRNA正义链：5'-GATCCTCAAGATGCCTCGTTATTGTTCAAGAGAC AATAACGAGGCATCTTGATTA-3'，反义链5'-AGCTTAATCAAGATGCCTCG TTATTGTCTCTTGAACAATAACGAGGCATCTTGAG-3'。该寡核苷酸链5'和3'端分别含有BamHⅠ 与HindⅢ的酶切位点，5'端19 nt编码siRNA正义链即靶序列，中间9 nt(划线部分)转录后形成茎环结构，3'端19 nt与5'端19 nt反向重复、编码siRNA反义链，3'末端TT为转录终止信号。按说明书寡核苷酸退火后形成双链，并插入到pSilencer 4.1 CMV的两个酶切点BamHⅠ、HindⅢ之间转化入感受态大肠杆菌，穿刺菌液接种于LB固体培养基，培养12 h送上海英骏生物技术公司测序并抽提质粒备用。

　　1.2.2 细胞培养和转染 在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液，37 ℃、5%CO2(V/V)饱和湿度条件下传代培养人胃癌SGC-7901细胞。转染前一天，用0.25%胰酶消化细胞并计数，在含血清，不含抗生素的培养基中，使其在转染当天密度达90%。用Opti-MEMⅠ培养基分别稀释质粒和Lipofectamine 2000试剂，5 min后将两者混合。混合物室温保温20 min。在加入复合物前先移去培养基，替换无血清培养基，将复合物加入细胞中。在37 ℃、5%的CO2中培养3 h后加入血清。继续培养24~72 h，隔天换培养基，检测各指标。实验分为3组：对照组：只加脂质体;阴性对照组：转染pSilencer 4.1 CMV-nonspecific质粒(Ambion 公司Cat# AM5779);GC-C siRNA组：转染靶向GC-C基因的siRNA(siRNA：脂质体=1︰2.5)。

　　1.2.3 RT-PCR检测GC-C mRNA的表达 按说明书用Trizol (Invitrogen Inc)提取细胞总RNA。应用 RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit (Fermenta Inc)将2 μg总RNA逆转录成cDNA。根据GeneBank GC-C基因序列(NM 004963)和内参照GAPDH基因序列(NM 002046)，利用Primer Premier 5.0软件，设计如下引物，并由上海英骏生物工程公司合成。GC-C引物上游：5'-AGTGACCTTGGATGACTGGG-3'，下游：5'- AGCTCCAGTGAGGGTGAAG A-3'，229 bp。GAPDH引物上游：5'-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3';下游：5'-TTCCCATTCTCAGCCTTGAC-3'，190 bp。25 μl PCR反应体系为：cDNA2 μl， 10×PCR Buffer 2.5 μl ，2mM dNTPmix 1 μl ，上、下游引物各1 μl，25 mmol/L MgCl2 1.5 μl，Takara Taq DNA 聚合酶0.25 U，ddH2O15.75 μl。反应条件：94 ℃ 3 min，接着94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环，最后72 ℃ 7 min。PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色照相，并用凝胶成像系统定量分析，以目的基因GC-C与内参照GAPDH条带的吸光度比值表示GC-C mRNA的相对表达量(以平均吸光度A值表示)。

　　1.2.4 间接免疫荧光检测GC-C蛋白的表达 转染后，去除培养基，PBS洗1遍。4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗两遍，0.1%TritonX-100进行膜通透5 min(冰上操作)，PBS洗两遍。加含5%兔血清、1%BSA的PBS封闭1 h。孵育GC-C一抗(1︰150)4 ℃过夜，PBS洗后加FITC标记的兔抗山羊IgG(1︰100)和Hochest染核(1︰200)4 ℃避光1 h，PBS洗3遍(避光)，缓冲甘油封片后，CLSM共聚焦显微镜(Leica SP2 Inc)观察。高倍视野下选取绿色阳性细胞3~5个，利用Leica confolcal software软件定量分析荧光强度，并重复3次(以平均荧光强度FI值表示)。

　　1.2.5 细胞黏附实验 按照Dean Sheppard[7]方法，将用PBS稀释的多聚赖氨酸(PLL)(100 μg/ml)，FN(1、5、10、20 μg/ml)，BSA(1%)各100 μl包被96孔板，37 ℃包被1 h后用PBS洗两遍，再用1%BSA封闭1 h，PBS洗两遍。3组细胞用2 mmol/L EDTA脱落收集后PBS洗两遍，用1%胎牛血清培养基制成细胞悬液，将细胞悬液尽可能调节成相同浓度，以每孔100 μl加入包被好的培养板中，37 ℃，5%CO2孵育1 h。取出96孔板，轻柔洗去未黏附的细胞，每孔加100 μl 4%多聚甲醛固定30 min洗去，每孔加0.5%结晶紫染色过夜，PBS洗3遍，然后每孔加20% SDS 100 μl室温避光孵育2 h，用Bio-RAD的LX800酶标仪测定(OD 570 nm)OD值。计算细胞黏附率(%)=(OD 570 nm细胞黏附于FN-OD 570 nm细胞黏附于BSA)/(OD 570 nm细胞黏附于PLL-OD 570 nm细胞黏附于BSA)。每组设6复孔，3组独立试验。

　　1.3 统计学方法 所有数据均以x±s表示，用Stata7.0软件进行One-Way-ANOVA分析，两两比较采用t检验。P<0.05示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 重组质粒测序分析结果 测序结果表明重组质粒siRNA编码序列和设计的靶片段完全一致，表明已成功建立了GC-C特异的重组载体psiRNA-GC-C(GC-C siRNA)(图1)。

　　2.2 GC-C siRNA对胃癌细胞GC-C mRNA和蛋白水平的影响 GC-C siRNA转染SGC-7901 72 h后，RT-PCR显示GC-C mRNA表达较对照组降低66.7%(图2)，(A值0.25±0.065比0.750±0.074，P<0.01)。免疫荧光检测，转染后细胞胞体绿色荧光强度明显下降，细胞核蓝色荧光强度无明显变化。将孵育GC-C抗体图与Hochest染核图叠加，定量分析示平均GC-C蛋白表达较对照组减少75.8%(FI值为26.39±2.05比109.25±8.13，P<0.05)(图3，见封三)。

　　2.3 GC-C siRNA下调细胞黏附能力 GC-C siRNA转染后明显地抑制肿瘤细胞对FN的黏附能力(P<0.05)。随着FN浓度增加，对照组的黏附率无明显变化，GC-C siRNA转染组黏附率有所提高，但均明显低于对照组(图4)。

　　3 讨 论

　　胃癌侵袭转移是多种基因及其蛋白表达产物协调作用的结果，其程度是影响预后的主要因素，但胃癌发生浸润转移的具体分子机制目前仍然不清楚。

　　鸟苷酰环化酶C是受体鸟苷酰环化酶家族成员之一，它由Schulz等[8]首先发现，是一种N-连接糖蛋白受体，分布于绒毛肠细胞的顶端 ，不在正常胃组织中表达。Birbe[2] 和Park[9]等研究表明所有肠型异型增生和肠型胃癌均表达GC-C，而正常胃黏膜不表达GC-C。研究还发现，胃腺癌组织GC-C异位表达与CDX2对其激活有关。CDX2特异性表达于肠黏膜, 正常胃黏膜不表达，可异位表达于肠化生上皮、胃腺癌和人胃腺癌细胞株[10]，继而GC-C异位表达。近年来Debruyne 等[11]研究证明胆汁酸可通过NF-kappaB 和CDX2途径使GC-C在食管细胞肠化生中异位表达。因此认为，GC-C的异位表达在肠上皮化生、异型增生、食管、胃腺癌发生、发展过程中可能发挥重要作用。

　　RNAi作为一种全新的基因沉默技术，其高效性和高度的特异性在疾病的基因功能研究和基因治疗方面得到了广泛应用。siRNA为RNAi过程中的关键效应分子，为达到对靶基因较稳定而持久的抑制效果，DNA载体尤其是病毒载体介导的siRNA细胞内表达技术倍受青睐。通常此类病毒载体多采用RNA聚合酶Ⅲ起动子H1或U6用于细胞内指导siRNA的合成[12]。然而，最新研究表明RNA聚合酶Ⅱ起动子在细胞内也能高效促进功能性siRNA的合成[13]。本实验使用的pSilencerTM4.1-CMV neo具有强效的RNA聚合酶Ⅱ起动子(cytomegalomavirus，CMV)。我们利用此病毒载体成功构建了GC-C siRNA。将此GC-C siRNA转染人SGC- 7901胃腺癌细胞后，有效抑制胃腺癌细胞GC-C 基因表达。SGC-7901胃腺癌细胞GC-C基因沉默后，体外细胞实验证实细胞黏附能力下降，提示在抑制GC-C此段基因后能逆转肿瘤细胞的恶性行为，GC-C在胃腺癌细胞的迁移和侵袭中可能起重要作用，下调GC-C可抑制胃腺癌细胞的迁移和侵袭能力。

　　【参考文献】

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