OATPC分子阳离子赖氨酸49突变体削弱其底物摄取能力

　　作者：杨聪,陈文生,邓国宏,汪荣泉,肖天利　　作者单位：重庆，第三军医大学西南医院全军消化病研究所、重庆市消化病研究所(杨聪、陈文生、汪荣泉、肖天利)，感染科(邓国宏)

　　【摘要】 目的 研究人肝脏特异的有机阴离子转运蛋白基因OATPC分子膜外区保守的49位阳离子赖氨酸，对其有机阴离子底物摄取能力的影响。方法 从人肝脏mRNA中克隆OATPC野生型基因全长cDNA序列，通过定点突变将高度保守的第49位赖氨酸残基突变为中性氨基酸苏氨酸，构建其C端的GFP融合蛋白的真核表达载体，转染HEK293细胞，观察突变体的细胞膜定位能力及底物摄取功能的变化。结果 OATPC野生型及突变体基因均能定位表达于HEK293细胞质膜;[3H]硫酸盐雌酮底物摄取实验显示，突变体5 min底物摄取量较野生型下降74.18%，浓度依赖的[3H]硫酸盐雌酮底物摄取动力学分析表明，突变体Km增高和vmax降低。结论 OATPC蛋白膜外区第49位赖氨酸是其关键的功能氨基酸，是其重要的功能结构单位。

　　【关键词】 OATPC,定点突变,底物摄取,HEK293细胞

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of the mutant of organic anion transporting polypeptideC (OATPC) positive ion lysine49 localized on the polypeptide extracellular loop in impairing uptaking ability of its substrate. Methods Full length cDNA of the wild type OATPC was cloned from human liver mRNA by RTPCR. Then, the highly conserved lysine49 residues were mutated to threonine by sitedirected mutagenesis technique to construct the eukaryotic expression vectors of C terminal GFP fusion protein. Targeting ability and its uptaking substrate capability of cell plasma membrane were observed by transfecting those constructs into HEK293 cells. Results Both wildtype OATPC protein and mutant were highly expressed on HEK293 cell plasma membrane. [3H] estrone sulfate substrate uptaking technique showed that the amount of substrate uptaken by mutant at 5 min had decreased by 74.18%, compared with the wild type OATPC protein. [3H] estrone sulfate substrate uptaking dynamics demonstrated that Km value increased but V max decreased in the mutant. Conclusion The conserved positive ion lysine49 on extracellular loop of OATPC may be a determinant amino acid in uptaking organic anion substrates.

　　【Key words】 OATPC; Sitedirected mutagenesis; Substrate uptake; HEK293 cell

　　OATPC(organic anion transporting polypeptideC)(SLC21A6)是人肝脏中特异性表达的有机阴离子转运多肽， 是OATPs大家族的重要成员。它分布在窦状间隙肝细胞基底侧膜上，参与肝脏摄取多种内源性和外源性有机溶质(如胆红素、某些药物和外源性有机毒素等)。相关研究发现起源于2亿年前的一种古老的海洋鱼类低等脊椎动物——多髦毛小“鳐”的肝脏，存在鼠和人等相似的有机阴离子转运系统，并克隆得到了一个在肝脏组织中特异性高表达的、原始的sOatp基因[1]。进一步对比“鳐”肝脏特异的sOatp和人肝特异性的OATPC分子的高同源性区域，结合其有机阴离子底物转运特性，发现OATPC分子膜外区第49位赖氨酸是高度保守的阳离子氨基酸。推测其与OATPC分子有机阴离子底物摄取功能密切相关，可能是关键的氨基酸基团。为验证此假说，我们从人肝脏mRNA中克隆OATPC全长cDNA序列，通过定点突变将第49位赖氨酸(阳离子氨基酸)突变为中性氨基酸苏氨酸，构建其C端的GFP融合蛋白的真核表达载体，实验观察野生型和突变体的细胞膜定位及底物摄取功能变化，以揭示OATPC转运多肽对有机阴离子底物的选择性转运的分子作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　反转录试剂盒、定点突变试剂盒购自Stratagene公司;pcDNA3.1、lipofectamine 2000、mRNA抽提试剂盒Trizol、Topo cloning试剂盒购自Invitrogen公司;放射性底物[3H]硫酸盐雌酮购自PerkinElmer Life Sciences公司;所有抗体(antiOATPC，antiCalnexin)均购自Santa Cruz公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 OATPC基因克隆及其野生型(wide type,Wt)和C端GFP野生融合型基因真核表达载体的构建：用Trizol试剂盒从新鲜人肝组织中抽提分离得到完整的mRNA，反转录为cDNA，设计其特异的Oligo引物ATCTATATTTCAATCATGGACCAAAATC，GACAATGTGTTTCACTATCTGCCCC以及终止密码突变引物TTGGAAACACAGAAGCAGAAGTGGC，经PCR扩增出OATPC全长cDNA(野生型和终止密码突变体)，通过Topo cloning技术自动连接装载入pCR2.1和pcDNAGFP载体，得到pCR2.1OATPC野生型质粒和pcDNAOATPCGFP野生融合型基因真核表达质粒。经DNA序列测定鉴定整个基因序列的正确性后，将OATPC野生型基因从pCR2.1OATPC野生型质粒中酶切后，转装到pcDNA3.1真核表达质粒中，得到不含GFP融合蛋白的pcDNA3.1OATPC野生型真核表达质粒。

　　1.2.2 对pcDNAOATPCGFP野生融合型基因膜外保守区第49位赖氨酸进行定点突变：用定点突变试剂盒将pcDNAOATPCGFP(Wt)融合基因定点突变;突变体(mutation,Mut)：49 Lys(K)→Thr(T)(AAA→ACA);突变引物为：5′GACACTAGGTGCAATTATTATGACAAGTTCCATCATTCATATAGAACGG3′。突变后经测序证实成功突变为苏氨酸。

　　1.2.3 Wt及Mut在HEK293细胞中表达后的细胞定位能力检测：将经多聚赖氨酸处理的2.0 cm×2.0 cm盖玻片放入6孔细胞培养板中，HEK293细胞按3.0×106/孔种植，用含10%胎牛血清的高糖DMEM(Hyclone)培养，待细胞生长铺底约60%时进行转染，将Wt及Mut用脂质体法转染HEK293细胞，转染2 h后经4%多聚甲醛固定,以野生融合型蛋白为阳性对照，共聚焦显微镜下观察OATPCGFP突变体的细胞膜上的定位情况。

　　1.2.4 Western印迹检测细胞总蛋白和膜蛋白中OATPC和Calnexin蛋白的表达：分别取细胞总蛋白20 μg或膜蛋白100 μg与等体积上样缓冲液混匀，直接上样，蛋白使用7.5% SDSPAGE电泳胶进行电泳分离，然后电转移至硝酸纤维素膜，丽春红染色确定上样的均一性和电转移效率，含1%脱脂奶粉的PBST室温封闭2 h，加一抗(1∶100)室温孵育过夜，用PBST洗去一抗后加入相应二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h。OATPC免疫印迹所用的同一硝酸纤维素膜上免疫复合物经洗脱以后，再与另一胞质蛋白Calnexin抗体孵育后，Western印迹检测OATPC和内参照Calnexin蛋白表达量。

　　1.2.5 Wt和Mut融合蛋白在HEK293细胞对底物[3H]硫酸盐雌酮摄取功能实验：HEK293细胞按2.0×106/孔种植于经多聚赖氨酸铺底处理的12孔细胞培养板中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM(Hyclone)培养细胞，待细胞生长铺底约80%～90%时进行脂质体法瞬时转染细胞，在转染24 h后，每孔细胞用DMEM(Hepes，25 mmol/L)1.0 ml漂洗1次，然后每孔加入含1.0 μl[3H]硫酸盐雌酮的DMEM(Hepes，25 mmol/L)200 μl，分别在0、5 min后在0 ℃(冰上)用DMEM(5%BSA，Sigma)400 μl漂洗1次，再用DMEM(Hyclone)400 μl漂洗3次;每孔加入1%SDS 100 μl裂解细胞，取部分细胞裂解液做液闪测定3H放射量，余下的细胞裂解液离心取上清测定蛋白浓度。另外，每孔加入200 μl不同浓度的[3H]硫酸盐雌酮溶液进行浓度依赖摄取实验，5 min后在0 ℃(冰上)DMEM(5%BSA，Sigma)400 μl漂洗1次，再用DMEM(Hyclone)400 μl漂洗3次;每孔加入1%SDS 100μl裂解细胞，取部分细胞裂解液做液闪测定3H放射量，余下的细胞裂解液离心取上清测定蛋白浓度。计算Wt、Mut两种融合蛋白对不同浓度[3H]硫酸盐雌酮的摄取量，运用米式方程作出摄取动力参数图，分别计算出Km值、vmax值。

　　1.3 统计学分析

　　数据用±s的形式表示，用SPSS 10.0统计学分析软件t检验对各组数据进行分析，比较各组间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Wt和Mut的亚细胞定位

　　应用激光共聚焦显微镜在HEK293细胞爬片质粒转染后24 h后观察细胞，细胞核经4′，6二脒基2苯基吲哚染色为蓝色。

　　我们可以看出：Wt的绿色荧光主要定位在细胞膜上，在胞质和胞核中的绿色荧光很少，说明了野生型具有在HEK293细胞上有良好的细胞膜定位能力，是能够充分在其胞膜上定位的。这也是发挥OATPC蛋白质摄取功能的基础。而从图2可以看出：Mut的绿色荧光也能够定位在HEK293细胞的胞膜上，但在其胞质中也可见较多的绿色荧光，说明了突变体蛋白在HEK293细胞膜定位能力与野生融合型相比可能有减弱。

　　2.2 Wt和Mut蛋白在HEK293细胞膜的表达

　　分离转染OATPCGFP融合蛋白基因(Wt和Mut)的HEK293细胞总蛋白和膜蛋白，分别以Western印迹检测OATPC和内参照胞质蛋白Calnexin表达量，结果显示Wt和Mut的OATPCGFP蛋白的表达量无明显差异。

　　2.3 Wt和Mut的5 min底物摄取量及动力学参数Km和vmax值

　　采用3个同样的对照孔进行实验，分别测定每一孔的放射量和蛋白浓度，经过换算来得到其摄取量。

　　我们可以看出与野生融合型相比较，突变融合型对硫酸盐雌酮摄取能力明显减弱，在5 min的摄取量下降了74.18%，两者经t检验，P<0.01，差异有统计学意义。我们进一步用不同浓度的[3H]硫酸盐雌酮进行摄取实验，得出各自的摄取动力曲线，并对两者的Km和vmax分别进行t检验，P<0.01。也说明了Mut对[3H]硫酸盐雌酮的摄取能力是明显降低的。

　　3 讨论

　　肝脏是维持人体正常机能的重要器官。其主要功能之一是从门静脉血液中摄取一些毒性的有机化合物，在肝细胞中加工、转化、代谢，再分泌到胆汁中，流经肠道随粪便排除体外，从而防止毒性物质在体内的聚集，发挥其解毒作用。肝脏摄取有机化合物溶质的功能在很大程度上主要由肝细胞膜上一组结构和功能相似的转运蛋白质介导，即有机阴离子转运多肽OATPs[2]。OATPC是仅在人肝脏组织中特异性表达的有机阴离子转运蛋白，是参与肝脏从血液中摄取、清除多种内源性和外源性有机溶质的重要膜蛋白[3]。已有的研究显示，OATPC对药物的转运是影响肝脏药物代谢的重要环节，有研究发现OATPC对在肝脏转化灭活药物的代谢特别重要，如新型他汀类降血脂药物普伐他汀[4-5]的代谢主要经肝细胞转运摄取、排泄清除，OATPC是其在肝细胞内摄入代谢的主要载体。抗结核药物利福霉素SV和利福霉素的临床治疗常可诱导患者出现高胆红素血症以及溴磺酚BSP清除率降低等肝功能损害的副作用，与这类药物抑制OATPC的活性有关[6]。OATPC参与非结合型胆红素的转运，其活性的减低可能与遗传性家族性非结合胆红素血症Gilbert综合征有关[7]。因此，研究其转运分子机制对于阐明家族性黄疸的发病机制、药物和毒素在肝脏的摄取转运过程具有重要的临床意义。

　　本研究中，我们发现OATPC分子第49位氨基酸是高度保守的阳离子氨基酸。在对美国非洲裔和欧洲裔人群调查的研究中发现，OATPC基因的单个碱基突变、尤其是发生于保守区的突变可以直接严重减弱它的摄取功能，少数突变是通过影响其在细胞内表达后的细胞膜定位而间接削弱其功能，而同源性较低的区域的突变对其功能影响很小或甚至没有影响[8]。而OATPC分子第49位氨基酸为高度保守的阳离子氨基酸，我们推测可能与其有机阴离子底物摄取功能密切相关。HEK293细胞是来源于人胚胎肾皮质的细胞系 ，具有生长速度快，倍增时间短，生物学性质稳定和易于转染基因的特性，并且其无内源性的OATPC的表达，因而选为实验转染细胞。

　　结果表明，第49位阳离子氨基酸赖氨酸突变为中性氨基酸苏氨酸后，从激光共聚焦图片可以看出在细胞膜的定位能力上野生型和突变体都能够在细胞膜上正确定位，但突变体除了在细胞膜上有表达外，与野生型相比在胞质中也似有较多表达。说明突变体的细胞膜定位能力与野生型相比可能是减弱的。虽然Western印迹检测结果显示Wt和Mut的OATPCGFP蛋白的表达量无明显差异，但从对底物的摄取能力来看，OATPC野生型对[3H]硫酸盐雌酮的摄取能力很高，而突变体对硫酸盐雌酮的摄取能力比较低，两者的Km和vmax说明野生型比突变体对硫酸盐雌酮具有更高的亲和力和更大的最大速度，经t检验，P<0.01，差异有统计学意义，说明突变体功能明显减弱。因此，我们认为第49位阳离子氨基酸赖氨酸突变为中性氨基酸苏氨酸后的OATPC的底物摄取能力显著降低。这可能与突变后的OATPC在细胞膜上的定位能力下降有关，但更有可能是由于阳离子氨基酸突变为中性氨基酸后，降低或者部分失去了对有机阴离子底物硫酸盐雌酮的结合、转运能力。

　　通过本研究我们认为OATPC分子的第49位阳离子氨基酸赖氨酸是OATPC分子重要的功能结构单位，对维持OATPC分子转运功能非常重要。

　　【参考文献】

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　　[2] Meier P J, Stieger B. Bile salt transporters. Annu Rev Physiol,2002,64:635-61.

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　　[4] Niemi M, Schaeffeler E, Lang T, et al. High plasma pravastatin concentrations are associated with single nucleotide polymorphisms and haplotypes of organic anion transporting polypeptideC (OATPC, SLCO1B1). Pharmac Ogen Etis,2004,14(7):429-440.

　　[5] Mwinyi J, Johne A, Bauer S, et al. Evidence for inverse effects of OATPC (SLC21A6) 5 and 1b haplotypes on pravastatin kinetics. Clin Pharmacol Ther,2004,75(5):415-421.

　　[6] Vavricka S R, Van Montfoort J, Ha H R, et al. Interactions of rifamycin SV and rifampicin with organic anion uptake systems of human liver. Hepatology,2002,36(1):164-172.

　　[7] Cui Y, Konig J, Leier I, et al. Hepatic uptake of bilirubin and its conjugates by the human organic anion transporter SLC21A6. J Biol Chem,2001,276(13):9626-9630.

　　[8] Tirona R G, Leake B F, Merino G, et al. Polymorphisms in OATPC: identification of multiple allelic variants associated with altered transport activity among European and AfricanAmericans. J Biol Chem,2001,276(38):35669-35675.