胃癌IκBα与核因子κB表达的研究

　　作者：蒲泽锦　　作者单位：汕头大学医学院第二附属医院消化内科

　　【摘要】 目的：研究IκBα与核因子κB(NF_κB)在胃癌组织中的表达，了解细胞内IκBα水平的变化对NF_κB活性的影响。方法：62例胃癌患者术后切取胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织，用免疫印迹法对胃癌组织及正常胃黏膜组织中IκBα与NF_κB表达进行配对研究。结果：59例胃癌组织中细胞浆IκBα水平表达下降，伴随细胞核NF_κB活性增强(P<001)，3例胃癌组织中IκBα及NF_κB活性与正常胃黏膜组织中无统计学意义。结论：胃癌组织细胞浆内IκBα水平下降有利于NF_κB异常活化。

　　【关键词】 胃癌,IκBα 核因子κB

　　[Abstract]Objective: To study the expression of inhibitor kappaBα(IκBα)and nuclear factor kappaB(NF_κB)in gastric carcinoma tissues and the influence of IκBα level on the activity of NF_κB. Methods: Western blot was used to examine the expression of IκBα and NF_κB in gastric carcinoma tissues and adjacent normal gastric mucosal tissues. The results were analyzed by comparing study. Results: Analyzed by comparing study, in 59 cases, the level of IκBα in cytoplasm decreased and the NF_κB expression in nucleoplasm increased, however in 3 cases there was no significant difference. Conclusion: The degradation of IκBα in cytoplasm is essential for the aberrant activation of NF_κB.

　　[Key Words]gastric carcinoma; inhibitor kappaBα; nuclear factor kappaB

　　核因子κB(NF_κB)可以和位于基因的启动子或增强子中相应的具有5′GGGRNNYYCC3′的κB序列位点结合，主要对基因的转录起促进作用，参与诸如免疫、生长发育、细胞成熟和凋亡等人体生理调节过程，与肿瘤发生关系密切[1]。IκBα是一种抑制性蛋白质，主要停留于细胞浆中。IκBα属于IκBs家族成员之一[2]。IκBs家族成员都含有6～7个锚蛋白重复序列，可以和NF_κB结合，阻止其向细胞核转移。当IκBα磷酸化后被水解释放出NF_κB才具有转录调节作用，但NF_κB活化并不一定需要IκBα降解[3]。本研究试图通过分析胃癌及其癌旁正常胃黏膜组织中细胞核内NF_κB和细胞浆中IκBα水平，以了解胃癌中NF_κB活化情况和细胞浆中IκBα水平的变化对NF_κB活化的影响。

　　1资料与方法

　　11研究对象2003_12～2006_10来自粤东地区的62例胃癌患者(无化疗史。男性35例，女性27例。年龄47～81岁，平均72岁)在我院行胃癌根治术。标本离体后30?min内分别于癌肿本身和距癌肿边缘5?cm以上的正常组织取材，NS清洗后，组织装入冰盒中转运至_80?℃冰箱保存。

　　12主要试剂

　　小鼠抗NF_κBp65单克隆抗体，IκBα多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国);Leupeptin，Pepstatin，Aprotinin(Amresco公司，美国);NC膜(Millipore公司，美国。孔径05?mm);pv_6000通用二抗试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，中国);ECL Kit(Santa Cruz公司，美国)。

　　13方法

　　131蛋白提取和保存新鲜胃黏膜组织置入预冷细胞浆裂解液中，迅速在低温环境中匀浆，匀浆后冰上静置10?min，然后加入体积分数10%的NP_40，混匀后4?℃下离心，小心吸取细胞浆蛋白，并保留备用。离心后的沉淀中添加细胞核裂解液，混匀后冰上静置30?min，4?℃再次离心，小心吸取细胞核蛋白，并保留备用。测定细胞浆和细胞核蛋白浓度后将提取物超低温保存。

　　132Western blot质量分数10%的PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳。每个泳道上样40?μg，电泳后转膜，将NC膜放置于质量分数5%的脱脂奶溶液中于4?℃冰箱封闭过夜，然后添加NF_κBp65一抗(1∶1?000稀释)室温孵育15?h，TBST漂洗3次后，加通用型IgG_HRP多聚体二抗室温孵育20?min，增强化学发光试剂处理，胶片曝光显影。

　　14统计学处理

　　使用Quantity One软件分析蛋白条带密度，并以第2期蒲泽锦等.

　　2结果

　　21细胞浆中IκBα表达59例胃癌患者体内癌细胞浆IκBα表达水平低于正常胃黏膜细胞，3例体内癌细胞浆IκBα水平与正常胃黏膜细胞无统计学意义(图1)。本组胃癌和正常胃黏膜组织电泳条带平均密度分析显示，正常胃黏膜细胞浆提取液中IκBα表达量显著高于胃癌(P<0.01)。

　　22细胞核中NF_κB表达

　　59例胃癌组织细胞核提取液中NF_κB表达水平高于正常胃黏膜，3例癌细胞浆IκBα水平与正常胃黏膜细胞无统计学意义，细胞核提取液中NF_κB的表达水平在胃癌细胞中表达仅仅稍高于正常胃黏膜细胞，表达均较前述59例弱(图2)。本组胃癌和正常胃黏膜组织电泳条带平均密度分析显示，正常胃黏膜细胞核提取液中NF_κB表达量显著低于胃癌(P<0.01)。

　　3讨论

　　NF_κB结合在IκBα的区域有1个约33个氨基酸结构基序组成的6个锚蛋白复合物。IκBα和NF_κB形成一个大的非连续性的结合表面，IκBα的第1～3锚蛋白复合物结合到NF_κB的核定位信号，第3～6锚蛋白复合物形成发夹结构连接到NF_κB的二聚化区域[4]。NF_κB同其成员IκBα结合的能力远大于同基因上κBs位点结合的能力，从而保证新合成的IκBα有能力将结合到DNA上的NF_κB分离，同时在核输出信号作用下促使NF_κB返回细胞浆中，从而使得NF_κB失去转录调节能力。NF_κB和MAPK都可以参与IκBα表达的调节。研究发现，细胞经过LPS处理后在40?min内出现IκBα蛋白的降解，随后出现IκBα　mRNA转录引起IκBα蛋白在3?h内快速恢复，Bortezomib(NF_κB抑制剂)可抑制LPS所致IκBα表达增加，MAPK抑制剂也会引起IκBα表达减少[5]。研究显示，胃癌组织中磷酸化IκBα水平较正常组织中增高[6]。我们在实验中发现，胃癌组织中大量NF_κB被活化，而细胞浆中IκBα水平下降较明显。二者并不矛盾，前者在于检测被磷酸化的IκBα水平，我们在实验中对NF_κB活化时细胞浆中IκBα总体水平进行了检测，结果在胃癌细胞内有大量的IκBα被迅速降解，超过其产生速率。在实验对象中有3例并没有出现明显的IκBα降解和NF_κB异常活化，我们推测在胃癌细胞内NF_κB可能是间歇处于高水平活化而非一直异常持续活化。NF_κB在胃癌中大量激活，这在我们以前的研究中和他人的研究中均有报道[7， 8]。最经典的NF_κB激活途径为NIK_IKK_IκB，IκBα的降解主要来自于其32及36位丝氨酸被磷酸化。但也有研究显示，在IκBα的降解可以不需要IKK的参与，某些抗肿瘤的药物可以在IKK缺陷的细胞中诱导IκBα降解逐渐增加及NF_κB相关基因表达增加[9]。

　　IκBα对NF_κB的活性有极大的影响[10]。虽然也有研究显示，NF_κB活化并不一定需要IκBα降解[3]，但本研究结果表明，IκBα的迅速降解明显促进NF_κB在胃癌细胞异常活化。胃癌是中国多发病且病死率很高，多年来对胃癌的防治进行了许多研究，效果不甚理想。从分子水平对其进行治疗是今后的趋势。本研究旨在从NF_κB的活化途径中探索出更有效的防治胃癌手段，期望能提高胃癌患者的生存率。

　　【参考文献】

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