IL-17A及Th17在炎症性肠病中的作用

　　作者：杨淑萍　智绪亭　卢雪峰　冯立娟　王琴伊　　作者单位：山东大学齐鲁医院　1消化内科　2普外科　(山东　济南　250012)

　　【摘要】目的：检测IL-17A、IL-10、IFN-γ在缓解期炎症性肠病(inflammatory bowl disease，IBD)患者中的表达，探讨诸炎症因子及Th17在炎症性肠病的发病及治疗中的作用。方法：应用ELISA检测12例Crohn病(Crohn disease, CD)、46例溃疡性结肠炎患者(ulcerative colitis, UC)和20例健康人(正常对照组)血清中IL-17A、IL-10和IFN-γ的水平，并用免疫组织化学法检测CD、UC及正常对照组结肠黏膜局部IL-17A的表达。结果：正常对照组结肠黏膜局部未检测到IL-17A的表达，而UC和CD组在结肠黏膜活组织中均检测到IL-17A的表达。同样UC和CD组血清中IL-17A明显增高，而正常对照组血清未检出IL-17A;UC和CD组患者血清IL-10水平均较对照组升高(P<0.05)，且CD组明显高于UC组(P<0.05);CD、UC组与正常对照组血清中IFN-γ的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论：IL-17A不仅在缓解期IBD患者结肠黏膜局部表达，同时在其血清中高表达，提示Th17及其分泌的IL-17A在缓解期IBD患者的发病过程中起重要作用，并伴随促炎因子和抑炎性因子失调。

　　【关键词】 结肠炎，溃疡性•Crohn病•白细胞介素17•白细胞介素10

　　【ABSTRACT】 Objective: To detect the expression of IL-17A、IL-10 and IFN-γ in patients wth different forms of inflammatory bowel disease(IBD) during clinical remission phase and investigate their role in the onset and treatment of IBD. Methods: Tissue samples were obtained from patients with ulcerative colitis (UC, n=46), Crohn's disease (CD, n=12), and normal colorectal tissues (n=20). IL-17A expression was evaluated by a standard immunohistochemical procedure. Serum IL-17A、IL-10 and IFN-γ levels were determined by ELISA. Results: IL-17A expression was not detected in samples from normal colonic mucosa but was present in the mucosa of IBD. The level of IL-17A significantly increased in IBD patients while it was not detected in the sera of normal individuals. The level of IL-10 in patients with Crohn's disease was significantly higher than that in patients with ul cerative colitis and control group (P<0.05 and P<0.05, respectively). Conclusions: The expression of IL-17A in both the mucosa and serum of remission IBD patients increased significantly, the imbalance between production of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines persisted even during remission of the disease.

　　【KEY WORDS】 Colitis, ulcerative•Crohn disease•Interleukin-17•Interleukin-10•Interferon type II

　　Thl7细胞是新近发现的一群以分泌IL-17A为特征的CD4+ T细胞亚群，具有促进免疫反应的效应，在以慢性炎症为损伤机制的自身免疫疾病中具有重要作用[1]。本研究主要从缓解期炎症性肠病(inflammatory bowel disease， IBD)患者局部组织及外周血检测IL-17A的变化，并探讨其与IL-10水平是否存在相关性,进而探讨Th1、Th2、Th17细胞在IBD发病中的作用。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料　收集2007年10月—2008年4月于山东大学齐鲁医院消化内科住院患者及内镜室行肠镜检查处于缓解期的IBD患者57例，其中溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)46例，男20例，女26例;年龄21～53岁，平均年龄39.7岁;Sutherland疾病活动指数≤2分。Crohn病(Crohn disease，CD)12例，男5例，女7例;年龄18～49岁，平均年龄37.1岁;简化CDAI≤4分，为缓解期患者。正常对照组为20名行肠镜检查为阴性的健康志愿者，年龄、性别比例与IBD组差异无统计学意义(P>0.05)。诊断标准依据：2007年中华医学会消化病学分会制定的中国IBD诊断治疗规范的共识意见，使用5-氨基水杨酸(5-ASA)于缓解期维持治疗。排除标准：尚使用激素的缓解期IBD患者;诊断不明确的各种肠炎;患有严重心、肝、肺、肾疾病;不能耐受结肠镜检查者;拒绝取活组织检查者或采静脉血者。

　　1.2　主要试剂　免疫组织化学试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，IL-17A抗体购于Santa Cruz公司，IL-17A、IL-10及IFN-γ ELISA试剂盒购于Bioscience公司。

　　1.3　方法

　　1.3.1　免疫组织化学法　采用0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液抗原修复，高压锅热修复。IL-17A抗体浓度为1:100，4 ℃湿盒孵育48 h。DAB显色，苏木精对比染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后封片。空白对照以PBS代替一抗。结果判定：以胞质出现黄色、棕黄色颗粒或染色者为阳性。

　　1.3.2　ELISA法　采集清晨空腹静脉血，离心后分离血清，置-80 ℃冰箱中保存，同批检测。ELISA操作步骤严格按照所购试剂盒说明书进行，在450 nm波及处测吸光度值A450。用标准物浓度与A450值计算出标准曲线的直线回归方程，将样品的A450值代入方程式求出样品浓度。

　　1.4　统计学处理　应用SPSS13.0统计软件包进行分析，数据以x±s表示，采用t检验对资料进行分析。以α=0.05作为检验水准。

　　2　结果

　　2.1　结肠黏膜活组织中IL-17A蛋白的表达　CD、UC组淋巴细胞胞质均出现IL-17A阳性染色，UC组阳性细胞主要存在于上皮的固有层淋巴细胞中，呈棕黄色，分布于腺体的周围，CD组的阳性细胞肠壁全层可见，在各层中的分布未见明显区别(图1)。正常对照组肠黏膜全层均未见阳性染色。

　　2.2　血清IL-17A、IL-10、IFN-γ蛋白的检测结果

　　2.2.1　IL-17A蛋白　正常对照组血清中未检测到IL-17A，UC和CD组血清IL-17A水平明显升高，CD组平均水平较UC组高，但差异均无统计学意义(P>0.05)。

　　2.2.2　IL-10蛋白　CD组IL-10表达水平高于UC组及正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，UC组与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

　　2.2.3　IFN-γ蛋白　CD组、UC组血清中IFN-γ的水平与正常对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

　　3　讨论

　　IBD是一类病因未明的胃肠道慢性复发性炎症性疾病，包括UC和CD。在欧洲，其发病率为(100～150)/10万[2]，IBD发病高峰年龄在20～40岁[3]，近年报道的病例明显增多[4]。虽然，IBD的确切病因仍不清楚，一种被普遍接受的假说是环境因素作用于遗传易感者，在肠道的正常菌群的参与下，启动了肠道免疫及非免疫系统，最终导致免疫反应和炎症过程，引起肠道黏膜过度炎症反应，介导肠道损伤。

　　传统观点根据分泌细胞因子的不同，通常把辅助性T细胞(T helper, Th)分为Th1和Th2两个亚群，Th1和Th2在免疫过程中相互调节并相互制约。最近有学者在对2种自身免疫性疾病动物模型的实验性自身免疫性脑炎和胶原诱导关节炎的研究过程中发现了一类新的T细胞亚群——Th17细胞，能够通过分泌IL-17A诱导严重的自身免疫反应，缺失Th17能防止或减轻自身免疫性脑脊髓炎的进展[5-6]，并且在多种自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、多发性硬化及哮喘等患者的血清及组织中IL-17高表达[7-9]。已有研究证实，在活动期IBD患者中，IL-17A的表达增加，并且与疾病的严重程度呈正相关[10]。本研究发现，缓解期的IBD患者，UC和CD组结肠黏膜活组织中IL-17A高表达，而在正常对照组结肠黏膜活组织中未检测到IL-17A的表达，提示在IBD患者结肠局部浸润的淋巴细胞中可能有Th17细胞的存在，同时也在血清中也检测到IL-17A，考虑Th17可能在IBD患者的全身免疫中也发挥着作用。

　　在正常状态下，体内的促炎因子与抑炎因子处于动态平衡，二者相互制约，从而维持机体内环境的稳定。IL-10主要由Th2细胞分泌，通过抑制巨噬细胞和单核细胞的抗原递呈功能，并下调Th1细胞IFN-γ的分泌，发挥其抗炎作用[11]。本研究发现在缓解期IBD患者中IL-10水平上调，可能是机体对炎症反应的代偿机制。同时有研究亦发现：IL-10敲基因鼠可以诱导实验性结肠炎[12]，同时UC患者肠黏膜局部及T细胞中IL-10表达明显增加[13]，IL-10水平的增高为一种保护因素。本研究同时发现IFN-γ表达在缓解期IBD患者与对照组相比差异无统计学意义，可能是因为使用5-ASA作为缓解期维持治疗造成的，而同为促炎因子的IL-17A在IBD患者中，仍较正常升高，其在缓解期IBD中的作用还有待于进一步研究。

　　总之，缓解期的IBD患者肠黏膜局部及外周IL-17A明显上调，并伴随着促炎因子与抑炎因子失调的现象。因此，Th17细胞在IBD的发病过程中，发挥着重要的作用，有可能成为未来IBD治疗的一个方向。

　　【参考文献】

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