消化性溃疡幽门螺杆菌感染与Toll样受体4基因多态性的相关性

　　作者：钟维敏,蒋益　　作者单位：325311 浙江省温州市文成县玉壶中心卫生院内科(钟维敏)325000 温州医学院附属第二医院消化内科(蒋益)

　　【关键词】 消化性 溃疡幽门螺杆菌感染 Toll样受体

　　HP感染是引起人类慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等疾病的病因之一，但研究发现在HP感染者中仅有极少数会发生上述疾病。HP 致病机制与细菌数量、毒力以及环境因素、宿主易感性、胃肠黏膜内环境等有关。人类TLR4通过识别病原相关分子构型(PAMPs),激活先天性免疫应答机制，同时还诱导共刺激分子CD80的表达，为获得性免疫的启动提供活化信号，因此在免疫系统中有着十分重要的作用[1]。TLR4作为细菌脂多糖(LPS)的受体, 将LPS传导通路的信号迅速传至核内, 通过激活核因子-kB(NF-kB), 刺激NO分泌, 消灭病原;还可促进炎性细胞因子表达与释放, 激活特异性免疫反应[2]。本研究通过探讨TLR4基因突变与HP感染相关性消化性溃疡的关系, 旨在为阐明HP 感染相关性消化性溃疡的遗传易感性和先天性免疫机制提供依据。

　　1 临床资料

　　1.1 一般资料

　　于2006年7月至2007年6月间，在温州医学院附属第二医院消化内科，依据悉尼分类标准[3]收集消化性溃疡患者120例(胃溃疡51例、十二指肠球部溃疡69例)。其中男72例, 女48例;平均年龄52.2岁。正常体检者204例作为对照组, 男104例, 女100例;平均年龄39.2岁。

　　1.2 方法

　　(1)取外周静脉血5ml， EDTA抗凝，蛋白酶K/酚/氯仿法提取基因组DNA。

　　(2)PCR扩增目的基因，根据文献设计引物[4]如下。

　　PCR反应体系25μl，每侧引物各10pmol，dNTPs(10mmol/L)0.5μl，DNA聚合酶1U,DNA模板1μl(约40-100ng)。反应条件：94℃预变性3min，接着38个循环，94℃变性45s，51℃复性45s，72℃延伸45s，72℃终末循环5min，最后于4℃终止反应。PCR产物片段长度139bp或131bp，用2%琼脂糖凝胶电泳及紫外分析仪鉴定。

　　(3)TLR4 Asp299Gly基因多态性分析：

　　①限制性内切酶消化PCR产物 酶切反应体系20μl，含10μl PCR(Ⅰ)的产物，用BsaBI 内切酶0.5μl(10U/μl)，于55℃消化酶切4h;取10μl PCR(Ⅱ) 的产物，用BstXI内切

　　酶0.5μl，于65℃消化酶切4h后 80℃灭活20min;②酶切产物用8%的非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳(100V,1.5h)分离，1‰硝酸银染色分析基因型;③基因测序：部分PCR(Ⅰ)及PCR(Ⅱ) 产物经纯化后由上海生工生物工程服务有限公司进行DNA测序，测序样品作为阳性对照;④消化性溃疡患者均采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HP-IgG。同时采用胃窦黏膜组织快速尿素酶试验(pH值指示剂法), 检测HP感染。诊断HP感染参照安徽桐城会议通过的共识意见[5], 2项均阳性诊断HP感染。正常体检者采用14C-尿素呼气试验, 检测HP感染，检测前所有研究对象均未行抗HP治疗。

　　1.3 统计学处理

　　SPSS 11.5软件处理试验数据，采用χ2检验分析病例组和对照组Asp299Gly基因型频率及等位基因分布的差异，以及分析TLR4基因Asp299Gly基因型与HP感染相关性消化性溃疡

　　之间的关系。P<0.05有显著性差异。

　　2 结果

　　浙江汉族人群中，TLR4基因Asp299Gly等位基因位点均为野生型A, 未见突变型G; A等位基因频率及AA基因型频率均为100%。消化性溃疡组及正常对照组TLR4基因Asp299Gly基因型频率，等位基因频率及携带者频率分布无显著性差异。

　　TLR4基因Asp299Gly多态性与HP感染关系，消化性溃疡患者中HP感染率为94.7%, 正常对照为60.1%; 两组中TLR4基因Asp299Gly基因型频率, 等位基因频率及携带者频率分布无差异,所有研究个体均为AA纯合子。

　　参照文献结果[6]，将汉族人群TLR4基因Asp299Gly多态性与外国人群比较，发现TLR4基因Asp299Gly等位基因频率及基因型频率存在种族差异。汉族人和日本人该等位基因均为野生型A，未发现突变型G;与荷兰高加索人相比，等位基因频率及基因型频率具有显著性差异。AA基因型频率在中国浙江汉族人群(χ2=33.064，P=0.000，OR=1.183，95%CI:1.080～1.296)及日本人群(χ2=42.682，P=0.0001，OR=1.183，95%CI:1.109～1.262)中显著高于荷兰人群;而荷兰人群等位基因A的频率明显高于中国人群(χ2=37.403，P=0.000，OR=1.098，95%CI:1.047～1.151)及日本人群(χ2=42.597，P=0.000，OR=1.125，95%CI:1.077～1.175)。由此可见中国及日本人群与荷兰高加索人TLR4基因Asp299Gly位点多态性分布存在显著性差异。

　　3 讨论

　　TLR是人类在进化过程中所保留的参与先天性抗感染的受体蛋白家族，具有高度保守性。TLR不仅通过识别病原微生物的PAMP, 激活先天性免疫反应, 还诱导共刺激分子CD80

　　的表达，为获得性免疫的启动提供必要的活化信号，因此在免疫系统中有着十分重要的作用。TLR超家族已发现有10个家族成员，其中TLR4、TLR2与宿主的免疫功能有着密切联系，可

　　识别不同的病原分子。TLR4主要作为革兰阴性菌LPS的特异性受体，在LPS诱导的信号传导中起着重要作用，TLR2则主要作为革兰阳性菌的肽聚糖、酵母菌的甘露聚糖及某些特定的LP

　　S的受体。TLR4接触不同的抗原分子后，通过协同分子CD14、LPS结合蛋白、MD2的共同作用，经由MyD88、TIRAP/MAL等信号传导途径，将LPS传导通路的信号迅速传至核内，激活NF-кB通道，刺激NO分泌，消灭病原菌;此外，激活相关细胞因子的表达，释放炎症细胞因子，激活特异性免疫反应，因而在机体的先天性免疫中起到十分重要的作用。Arbour等用单链构象

　　多态性分析法(PCR-SSCP)和基因测序的方法发现了TLR4基因的非同义的单核甘酸多态性Asp299Gly和Thr399Ile，除体外转染研究证实Asp299Gly多态性与LPS的反应减低有关外，Asp299

　　Gly和Thr399Ile等位基因杂合子和纯合子个体与野生型基因型的个体相比，吸入性LPS的气道反应明显减低。小鼠C3H/HeJ和C57BL/10ScCr株对LPS高度抵抗，缺乏先天性免疫的生物作

　　用，易受感染,是由于小鼠TLR4基因突变导致对LPS无反应，或LPS信号传导异常所致。野生型TLR4的表达增强可使LPS的信号增强。研究发现TLR4基因的突变可改变肠黏膜先天性免疫细胞和肠上皮TLR4分子结构，使机体的免疫系统失去正常处理肠腔内的大量细菌和LPS等病原分子的能力，进而使肠黏膜在长期的刺激下产生感染、炎症、过敏、易激乃至癌变。

　　流行病学调查结果显示：人群中HP感染率与其社会经济地位关系密切， 发达国家成人HP感染率<40%,而我国人群感染率为20%～80%，明显高于经济发达国家。本研究中, 正常浙江汉族人群HP感染率是60.1%, 与以上的研究结果一致。同时已有大量研究资料显示: HP感染率高的地区和国家人群的胃炎和消化性溃疡的发病率也较高，如经济落后国家同发达的欧美国家比较, HP感染相关性胃炎和消化性溃疡的发病率也高。 通过对浙江汉族人群HP感染的检测, 发现消化性溃疡患者组HP感染率显著高于对照组(P=0.000, OR=12.512,95%CI:5.255～29.792)。本研究采用PCR限制性片段长度多态性分析的方法, 对120例消化性溃疡患者及204例正常对照者TLR4基因sp299Gly基因型及等位基因分布进行检测, 发现所有样本均为野生型基因型, 提示在中国浙江汉族人群中罕见TLR4基因Asp299Gly突变基因型。

　　树突状细胞(DC)是重要的抗原提呈细胞，在机体免疫应答过程中起着至关重要的作用。目前研究发现胃黏膜上皮DC能穿过胃上皮细胞间的紧密连接, 到达胃黏液层与HP接触[7], HP能够特异性地定植于胃黏膜的黏液层下的上皮细胞表面;另发现在活体内胃上皮细胞可以表达TLR[8]。国外Bauditz 等[9]对HP感染相关性胃炎进行研究, 发现LPS引起胃黏膜单核细胞分泌大量IL-12, 在胃粘膜上皮细胞表达的TLRs与HP的LPS相互作用后, 通过TLR4/CD14途径激活单核-巨噬细胞分泌细胞因子, 如TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8等, 引起胃黏膜的炎症。Su 等[10]发现与临床相关的Ⅰ型HP和Ⅱ型HP感染能激活TLR4基因的表达, Kawahara 等[11]发现Ⅰ型HP的脂质A可以激活TLR4途径。本研究将汉族消化性溃疡患者按HP感染分类后, 未发现TLR4基因Asp299Gly突变基因型, 与正常对照组相比无显著性差异，提示TLR4基因Asp299Gly多态性与汉族HP感染相关性消化性溃疡的发生无相关性。

　　本研究将中国浙江汉族人群与其他人种的TLR4基因的Asp299Gly多态性分布进行分析比较，发现不同人群中TLR4基因Asp299Gly等位基因频率及基因型频率的分布存在显著性差异。其中中国汉族人与日本人的Asp299Gly等位基因频率及基因型频率分布无明显差异性, 即在所检测的样本中均未发现TLR4基因Asp299Gly的突变基因型, 与荷兰高加索人群突变频率存在明显差异，提示由于欧亚人种在TLR4基因Asp299Gly等位基因及基因型频率分布的不同,导致种族差异和遗传背景的不同, 从而影响TLR4基因多态性在消化性溃疡等疾病的遗传机制中的作用。另外由于CD14是TLR4信号传导途径中重要的协同分子，CD14基因多态性在不同人种之间的分布差异也可能影响TLR4在HP的 LPS抗原呈递和胞内信号传导过程中所发挥的作用。

　　【参考文献】

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　　11 Kawahara T, Teshima S, Oka A. Type I Helicobactr Pylori lipopolysaccharide stimulates toll-like receptor 4 and activates mitogen oxidase 1 in gastric pit cells. Infect Immun 2001,69:4382～4389.