奥曲肽对肝星状细胞整合素信号通路的影响

　　作者：尹凤荣,张晓岚,桑荣霞　　作者单位： 河北省石家庄市第五医院感染一科(尹凤荣);河北医科大学第二医院消化内科(张晓岚);河北省石家庄市第一医院消化内科(桑荣霞)

　　【摘要】目的通过研究奥曲肽对肝星状细胞(HSCs)整合素信号通路的影响，探讨奥曲肽抑制HSCs增殖的机制。方法体外培养HSCs，MTT法测定HSCs增殖，Western blot测定细胞外信号调节激酶(ERK1)蛋白表达。结果干预24 h，Ⅲ～Ⅴ组吸光度(A)值均显著低于Ⅱ组，抑制率分别是18.75%、37.50%和40.63%,差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅰ组有ERK1蛋白表达，OPN刺激24 h后，ERK1蛋白含量较Ⅰ组高95.62%;Ⅲ～Ⅴ组ERK1蛋白含量则分别低了16.74%、34.30%和65.72%。结论奥曲肽能够通过下调整合素信号通路中的下游信号分子——ERK1，抑制骨桥蛋白刺激的HSCs增殖。

　　【关键词】 肝纤维化,肝星状细胞,奥曲肽,整合素信号通路

　　【Abstract】 Objective To investigate the action mechanism of octreotide in inhibiting proliferation of hepatic stellate cells (HSCs) through observing the effect of octreotide on the integrin signaling pathway.MethodsThe cells were cultured in vitro,and the proliferation of HSCs was detected by methyl thiazolyl tetrzolium(MTT) assay.The extracelluar signalregulated kinase1 (ERK1) protein expressions in HSCs were analyzed by Western Blot.Results As compared with osteopontin(OPN) group, octreotide at concentrations of 2.5mg/L,5.0mg/L and 10.0mg/L could inhibit the proliferation of HSCs.The inhibition rates were 18.75%,37.50% and 40.63% respectively(P<0.05).The expression levels of ERK1 protein in control group were higher,after stimulated by OPN,the protein expression of ERK1 increased by 95.62%.After exposed to octreotide for 24h, ERK1 production decreased by 16.74%,34.30% and 65.72%,respectively for group 2.5mg/L,5.0mg/L and 10.0mg/L.Conclusion The octreotide can inhibit the proliferation of HSCs stimulated by OPN through downregulating ERK1 protein expression, which is the downstream signal molecule of the integrin signaling pathway.

　　【Key words】 hepatic fibrosis;hepatic stellate cell;octreotide;integrin signaling pathway

　　肝纤维化是临床面临的重要问题，其发病机制是一个复杂的级联反应，包括肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化、增殖、表达各种信号分子及产生大量以胶原为主的细胞外间质(extracellular matrix，ECM)成分[1]。整合素信号通路在活化HSCs增殖过程中发挥重要作用[2]。我们分析奥曲肽对HSCs整合素信号通路的影响，旨在探讨奥曲肽抑制HSCs增殖的机制，寻找新的抗肝纤维化治疗靶点。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与仪器 RMPI1640培养基为美国Gibco公司产品;甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自美国Sigma公司;骨桥蛋白(osteopontin，OPN)由河北医科大学生化室惠赠;奥曲肽(octreotide)为瑞士诺华制药有限公司产品;兔抗ERK1单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品;HRP标记的山羊抗兔IgG购自北京中山生物技术公司;主要仪器有超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、Wellscan MKII酶联免疫仪、电泳仪、垂直电泳槽及垂直转膜槽。

　　1.2 细胞株及细胞培养 肝星状细胞株CFSC由美国纽约Albert Einstein医科大学Greenwel教授建株并惠赠，其表型为活化的HSCs。细胞置于含10%胎牛血清的RMPI1640培养液，37℃、5% CO2条件下培养。每次实验均在呈指数生长的细胞中进行，培养箱中孵育至细胞近100%汇合时，弃培养液，换不含胎牛血清的RPMI1640培养液继续培养24 h，使细胞基本同步化于G0期后再进行分组(每组6复孔)：Ⅰ组对照组;Ⅱ组OPN组(32 mg/L);Ⅲ组OPN+奥曲肽(2.5 mg/L);Ⅳ组OPN+奥曲肽(5 mg/L);Ⅴ组OPN+奥曲肽(10 mg/L)。Ⅲ～Ⅴ组中OPN浓度均为32 mg/L。干预过程中胎牛血清浓度为2%。

　　1.3 MTT法测定HSCs增殖 按上述方法将5×103个细胞接种于96孔培养板，进行同步化处理及分组，此时培养液中胎牛血清浓度均为2%。37℃培养12、24和48 h后再加MTT溶液(5 g/L)，继续孵育4 h，弃上清夜，加入DMSO，用酶联免疫检测仪于490 nm波长处测出各孔吸光度(A)值，按下式计算细胞抑制率：[Ⅱ组A值-Ⅲ组A值]/(Ⅱ组A值)×100%。

　　1.4 蛋白提取液的制备 按以上分组培养瓶内培养24 h后，弃上清，冰冷的PBS漂洗2次，应用改良的RIPA裂解缓冲液(50 mmol/L TrisHCl，pH值7.5;150 mmol/L NaCl;1% NP40;0.5%脱氧胆酸钠;0.1% SDS;1 mmol/L EDTA;1 mmol/L PMSF;2 mg/L leupeptin)制备蛋白提取液，考马斯亮蓝比色法测定蛋白含量。

　　1.5 Western blot 取70 μg蛋白，进行10% SDSPAGE分离，转膜，分别用兔抗ERK1单克隆抗体(1∶300稀释)、二抗(1∶3 000稀释)与硝酸纤维素膜杂交。最后将膜DAB显色5～10 min，至膜上出现棕黄色条带。采用美国Kodak公司ID数码成像分析系统软件对Western印迹结果进行定量分析。

　　1.6 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以±s表示，多组间均数差异性比较采用单因素方差分析及q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 奥曲肽对HSCs增殖影响的量效关系 奥曲肽在2.5～10.0 mg/L范围内，浓度越高，对HSCs的A值抑制作用越强，抑制率分别是18.75%、37.50%和40.63%。

　　 24 h不同浓度奥曲肽对HSCs增殖的影响n=6，±s

　　2.2 ERK1在奥曲肽抑制HSCs增殖过程中的表达 Western blot分析显示，HSCs同时表达ERK蛋白的两种同型体，即ERK1和ERK2，分子量分别是44 kD和42 kD。从杂交信号的强度可知，对照组有ERK1蛋白表达，作用24 h后，Ⅱ组比Ⅰ组高95.62%。而Ⅲ～Ⅴ组与Ⅱ组比较，ERK1蛋白表达明显被抑制，分别低16.74%、34.30%和65.72%。

　　 不同浓度奥曲肽对ERK1(P44MAPK)蛋白表达的影响n=6,±s

　　3 讨论

　　HSCs与ECM之间存在着复杂的相互作用，一方面HSCs通过表型转换，可合成、分泌大量ECM;另一方面ECM对HSCs表型转化、迁移、增殖及凋亡等生物学行为也具有重要调节作用。整合素(integrin)信号通路是介导细胞与ECM间相互作用的重要通路之一。整合素属于跨膜糖蛋白，是由α、β两种亚基组成的异源二聚体，其配体主要是OPN、纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)等ECM成分。整合素识别这些配体上特异的精氨酸甘氨酸天冬氨酸(ArgGlyAsp，RGD)序列并与之结合，引起整合素聚集、粘着斑形成、粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)酪氨酸磷酸化、RAS活化，进而刺激丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，mAPK)级联反应，调节基因表达。细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)是MAPK家族中研究最清楚的成员之一，包括两个亚型，ERK1(P44MAPK)和ERK2(P42MAPK)，其通路RASRAFMEKERK的激活促进细胞增殖，抑制细胞凋亡[3]。此次研究中，OPN刺激24 h后，较对照组A值、ERK1蛋白含量明显增加，证实OPN通过上调整合素信号通路中的下游信号分子ERK1，促进HSCs增殖。

　　奥曲肽为人工合成的环状8肽，是天然生长抑素(somatostatin，SST)的类似物，半衰期长，是临床治疗门脉高压静脉曲张破裂出血的常用药物，对多种正常及肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，对HSCs也有抑制其活性和增殖的作用[4]。此研究显示奥曲肽抑制OPN刺激的HSCs增殖，并且具有明显的剂量依赖关系，再次证实了奥曲肽对HSCs增殖的抑制作用。

　　SST的抑制作用可通过影响生长因子、营养激素的释放，抑制血管生成，调节免疫等间接作用或者是通过特殊受体对靶细胞的直接作用来完成。后一种作用由SSTR 1、2、4、5介导，通过与G蛋白藕合，SSTR可抑制腺苷酸环化酶活性，使细胞内cAMP水平降低，进而激活蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)，调节MAPK活性，影响cfos，cjun，cmyc的转录，最终阻碍细胞增生，并致细胞G0/G1期阻滞[5]。Reynaert 等[6]研究表明HSCs活化后表达SSTR 1、2、3，SST类似物奥曲肽对SSTR 2、5具有高亲和力，对SSTR3有轻度亲和力[7]。奥曲肽可能通过SSTR抑制HSCs增殖。此研究中表明，奥曲肽抑制ECM成分——OPN刺激的HSCs增殖，并且在此过程中，明显抑制了ERK1的活性。SST抑制细胞增殖受体通路与ECM成分刺激HSCs增殖整合素信号通路中，均可影响MAPK活性。奥曲肽有可能与HSCs上的特异受体结合后，一方面抑制腺苷酸环化酶活性，降低细胞内cAMP水平与MAPK活性，影响cfos，cjun，cmyc的转录，致细胞G0/G1期阻滞，同时抑制了交汇于ERK的OPN刺激的整合素信号通路，从而抑制OPN刺激的HSCs增殖。奥曲肽能够抑制整合素信号通路中的下游信号分子ERK1，抑制ECM刺激的HSCs增殖，有可能成为抗肝纤维化治疗新的靶点。

　　【参考文献】

　　1 房澍名，姚科梅，王军民，等.益肝康及其拆方对肝星状细胞活化增殖及胶原代谢影响的研究.河北医药，2008，30：1481.

　　2 郝礼森，张晓岚.肝星状细胞增殖过程中的信号转导及可能的抗肝纤维化治疗靶点.临床肝胆病杂志，2009，25：6367.

　　3 张晓岚，姜慧卿.整合素细胞信号转导通路与肝星状细胞行为.中国病理生理杂志，2003，19：987991.

　　4 戴永美，蔡立勉，张爱.生长抑素与肝星状细胞的研究进展.临床肝胆病杂志，2007，23：312314.

　　5 Stetak A，Lankenau A，Vantus T，et al.The antitumor somatostatin analogue TT232 induces cell cycle arrest through PKCdelta and cSrc.Biochem Biophys Res Commun，2001，285：483488.

　　6 Reynaert H，Vaeyens F，Qin H，et al.Somatostatin suppresses endothelin1induced rat hepatic stellate cell contraction via somatostatin receptor subtype 1.Gastroenterology，2001，121：915930.

　　7 Bosch J，Lebrec D，Jenkins SA.Development of analogues：successes and failures.Scand J Gastroenterol，1998，226：313.