生存素与消化道肿瘤关系的研究近况

　　作者：刘敏姬　沈守荣 作者单位：410013 湖南长沙,中南大学湘雅三医院消化内科(△通讯作者)

　　【摘要】 生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成员，具有肿瘤特异性表达的特点，通过针对生存素的反义寡核酸技术等途径可以抑制生存素的表达，从而诱导消化道肿瘤细胞的凋亡、抑制细胞增殖并增强化疗药物的敏感性。生存素可能在消化道肿瘤诊断、治疗和预后判断方面具有重要意义。

　　【关键词】 生存素　反义寡核苷酸　消化道肿瘤

　　Relationship between survivn and digestive tract tumor

　　LIU Min-ji,SHEN Shou-rong.Department of digestion of Third Xiangya Hospital Affiliated to the Central South University,Changsha 410013,China

　　[Abstract] Survivin is a member of inhibition apoptosis protein family with specificity expression in tumor.To aim directly at survivin by antisensen oligonucleotide technology can inhibit expression of survivin,induce apoptosis of digestive tract tumor,suppress cell proliferation and reinforce sensibility of chemotherapy drug.Survivin could be an important role in diagnosis,treatment and prognosis of digestive tract tumor.

　　[Key words] survivin;antisense oligonucleotide;digestive tract tumor

　　近年来研究发现生存素(survivin)与消化道肿瘤关系密切，其不仅在消化道肿瘤中有较高的表达，并可能参与肿瘤的发生、发展和化疗耐药。多方面研究提示生存素可能是一种癌基因，是一个有潜在价值的肿瘤标志物，可以用于肿瘤的早期诊断、治疗及预后判断。现就生存素与消化道肿瘤关系的研究进展做一综述。

　　1 生存素的简介

　　1997年耶鲁大学的Altieri等[1]用效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell protease receptor-1,EPR-1)cDNA在人类基因组文库中筛选克隆出IAP(inhibitor of apoptosis protein)家族又一新成员—生存素(survivin)基因。Survivin基因全长14796 bp，位于17q25染色体上， 由4个外显子和3 个内含子组成。核酸序列分析显示，survivin与EPR-1相比有5个碱基序列不同，另有6个bp插入，基因编码方向与EPR-1相反。通过内含子与外显子交界处剪接位点判断，survivin基因编码链包含1个互补EPR-1的426个核苷酸(nt)的开放阅读框，起始于外显子上游2560-2920位的无TATA启动区和250nt长的GC富集区，终止于12042位的TGA密码。Survivin蛋白含有142个氨基酸，分子量为16 000，等电点为5.74，是最小的ITP家族成员。X-衍射晶体学测定显示，Survivin分子以同二聚体形式存在，但存在两种不同的二聚体结构模式：弓结型模式和锌螯合模式，人类的survivin的2个分子主要通过疏水作用形成弓结型二聚体[2]。

　　2 生存素与消化道肿瘤的发生

　　2.1 生存素与肿瘤细胞凋亡 利用免疫组织化学法对32例胃癌及癌旁组织进行生存素蛋白表达的检测，发现生存素蛋白阳性产物定位于胞浆中，32例胃癌组织平均凋亡指数为(5.6±0.6)%，其中20例 生存素表达阳性组织的平均凋亡指数为(3±0.6)%，12例生存素表达阴性组织的平均凋亡指数为(11±0.9)%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，这表明可抑制胃癌细胞的凋亡[3]。Wakana等[4]也发现survivin mRNA与细胞凋亡指数呈负相关。那么，生存素究竟是怎样抑制细胞凋亡的呢?体外实验[5]表明，生存素特异性地结合于细胞凋亡蛋白酶的终末阶段分子caspase-3和caspase-7，而不是起始阶段的caspase-8，由此对暴露于多种凋亡刺激因素如Fas(CD95)、Bax以及化疗药物的细胞起到抑制 caspase 活性和细胞凋亡的作用。生存素还通过与纺锤体纤维的结合，间接抑制caspase对纺垂体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞器的完整性，抑制细胞凋亡[6]。如果生存素过度表达，细胞就会失去正常增殖周期中凋亡“开关”的限制，造成细胞增殖增加，凋亡减少，细胞增殖与凋亡的平衡打破，最后导致癌症的发生(见图1)。Li等用免疫组化检测survivin、cyclinD1的表达，结果显示cyclinD1与正常组织的增殖密切相关，并与survivin的表达呈明显的正相关，提示survivin在对细胞凋亡抑制的同时，使得cyclinD1过度表达，细胞持续增殖，导致肿瘤的复发、转移[7]。

　　2.2 生存素与肿瘤血管形成 大肠癌等实体瘤的直径大于2 mm时，其生长需要有血管提供营养，为了维持恶性肿瘤无限制侵袭性生长，肿瘤必须依赖新血管生成。1999年，Tran等[8]发现血管内皮生长因子VEGF能诱导人脐静脉内皮细胞的survivin表达上调19.1倍，研究表明survivin在血管内皮生长因子作用与血管内皮细胞中发挥了重要作用。杨景等[9]对癌组织的VEGF表达进行了检测，结果显示survivin与VEGF表达显著正相关，说明二者可能有密切关联，并由此推测survivin与VEGF之间可能存在正反馈调节，VEGF表达诱导survivin的上调，survivin表达也可能通过抑制血管内

　　图1 生存素抑制细胞凋亡、促进细胞增殖机制

　　皮细胞凋亡而提供其生长优势，促进其结直肠癌的血管生成，进而促进肿瘤的血行转移。有研究发现，survivin表达阳性组中微血管密度(microvessaldensity,MVD)指数显著高于survivin mRNA阴性组，提示survivin与癌组织血管形成密切相关[10]。其作用机制可能是：survivin作为微血管动力的稳定因子，调节细胞顺利分裂，保护细胞的完整性，新生血管可持续不断地为肿瘤细胞提供营养和氧气。

　　3 生存素与消化道肿瘤的诊断

　　Survivin在人类大多数恶性肿瘤中高表达，而在正常成人组织则低表达或不表达[1]，使其可成为癌细胞中特异性表达的标志物，能在消化道肿瘤的诊断中具有重要意义。Yu[11]发现，在原发性胃癌组织和胃癌细胞株中有survivin mRNA表达，而正常胃黏膜则无。Lu[12]等采用RT-PCR及免疫组织化学两种方法检测胃癌组织中survivin mRNA及蛋白的表达情况，结果显示，62.5%的胃癌组织有survivin mRNA和蛋白的阳性表达，而癌旁组织除了部分非典型增生组织有极弱的survivin mRNA表达外，其余无一例阳性表达。提示Survivin可能参与肿瘤的发生、发展，其表达可能是癌变的早期事件。

　　另外，因为生存素在正常组织中检测不到，肿瘤病人免疫系统可能将其识别为非自身抗原，从而激发针对性免疫反映。基于此，测量血清生存素抗体可能提供一种有效的肿瘤诊断工具。Rohayem[13]在癌症病人血清中证实有抗survivin抗体的存在。他们收集健康年轻人和癌症病人的血样，用纯化的氨基端His标记的重组survivin蛋白在血清中检测抗survivin抗体。结果显示，结直肠癌病人中具有抗survivin抗体阳性反映者为21.6%，健康人血清中则无抗survivin抗体存在。用重组的肿瘤不相关蛋白作对照抗原或癌症病人血清先用survivin封闭后，也无survivin抗体阳性反应，说明个体对survivin的识别具有特异性。抗survivin抗体的高发现率，使得该抗体有可能成为有助于结直肠癌诊断的最有潜力的新靶标。

　　4 生存素与消化道肿瘤的治疗

　　生存素的选择性表达特性，使得应用survivin特异性抗体免疫治疗以及反义survivin基因治疗具有良好的靶向性，特点性和安全性。目前研究较多的是利用特异性靶向生存素的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)来抑制生存素基因的表达，从而到达诱导肿瘤细胞凋亡和提高肿瘤细胞对化疗敏感性的目的。

　　4.1 生存素反义寡核苷酸诱导肿瘤细胞凋亡 采用生存素ASODN进行抗癌治疗具有广谱性和副作用小的特点，它是根据碱基互补原理，用人工合成的特定DNA或RNA片段ASODN分子与进入细胞质的mRNA上的特定点相结合，形成DNA-RNA复合物，抑制mRNA与核糖体结合，同时激活RNA降解酶H，降解mRNA机制从而抑制或封闭基因的表达，干扰致病蛋白质的产生[14]。谭继宏等[15]发现瞬时转染生存素反义寡核苷酸后，结肠癌细胞株SW116中生存素蛋白水平明显降低，caspase-3活性则显著增加，提示针对生存素基因的反义寡核苷酸可以启动相关细胞凋亡途径而诱发结肠癌细胞的自杀行为，并且不需联合应用基因毒性或化疗药物。近年来，生存素反义寡核苷酸作为肿瘤基因治疗的一种可能性选择，已在动物实验中得到证实。应用反义技术，针对生存素基因合成一段长20个碱基的ASODN，在24只裸鼠建立人胃癌细胞系HS-746T皮下移植模型，结果表明，对照组裸鼠皮下移植瘤内，肿瘤成持续性增长;而脂质体ASODN则能明显的抑制移植瘤的生长[16]。

　　天然的反义生存素效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell protease receptor-1,EPR-1)与survivin位于染色体(17q12)的同一个基因组，且2个基因的编码序列广泛互补，故通过2个天然反义转录物的相互作用可以调节细胞凋亡，而且利用EPR-1转录来抑制生存素的抗肿瘤疗法可以克服反义寡核苷酸基因治疗存在的特异性有限且输送量不足的缺点。Ambrosini等[17]把EPR-1 cDNA转染到Hela细胞中，EPR-1 mRNA的表达抑制了内源性生存素的表达，并引起细胞大量凋亡，同时细胞增殖也受到了抑制。

　　4.2 生存素反义寡核苷酸增强化疗药物的敏感性 化疗药物耐药性的产生是影响肿瘤化疗疗效的主要原因，肿瘤细胞凋亡机制的缺陷是耐药性的产生，从而达到提高肿瘤化疗疗效的目的。有研究发现，ASODN转染后的肝癌细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)和顺铂(DDP)的敏感性明显增加，提示生存素蛋白表达所引起的肿瘤细胞凋亡机制的缺陷，在一定程度上使细胞耐药性逆转[18]。刘江伟等[19]发现应用脂质体介导的survivin 反义核苷酸可增加胰腺BxPC-3细胞对吉西他滨的化疗敏感性。Dai等[20]研究证明survivin在人肝癌细胞多耐药模型(HepG2/ADM)细胞表达上调与其耐药性密切相关，反义复合物能有效下调survivin表达水平，并且增强耐阿霉素细胞HepG2/ADM对阿霉素的敏感性。

　　5 生存素与消化道肿瘤的预后

　　survivin不但是消化道肿瘤早期诊断的一个潜在的标志物，也将是判断预后的较佳指标。曹文俊等[21]应用免疫组化技术和实时定量PCR技术对结肠癌患者的癌组织、外周血、非癌性结肠病变组织和健康者外周血作了生存素蛋白和mRNA的表达研究，81.5%的结肠癌患者外周血中可检测到生存素转录本，而30名正常人外周血中均未检测到。结肠癌患者外周血中检测到其转录本可能是由于部分肿瘤细胞从肿瘤灶脱落进入外周血，虽然其中大部分能被机体免疫系统清除，但少数可在外周血中残留较长时间，最终在其他组织形成转移灶。因此，外周血中检测到肿瘤细胞所表达的基因转录本可能是肿瘤转移的早期事件[22]。有研究发现，91例 结直肠癌的癌细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)在0.21%～3.41%之间均数为0.97%，高AI者(AI≥0.97)的术后生存期平均为118.4个月，低AI者(AI<0.97)只有90.4个月，前者的5年生存率为88.1%，显著高于后者(64.4%)，survivin阳性患者的AI均数是0.74%，阴性患者的AI均数为1.07%，二者之间差异有统计学意义。该实验结果提示survivin可能是有效预测结直肠癌预后的标记物，同时提示survivin表达上调，促进结直肠癌的血管生成是导致患者预后不良的重要原因[8]。李春生等[23]则发现survivin的表达与组织学类型和淋巴结转移密切相关，其阳性表达组的AI显著低于阴性组，其阳性表达者术后5年复发转移率均较阴性显著增高，而5年生存率则较之显著降低，这说明survivin在人体恶性肿瘤中的高表达可作为判断术后易复发、转移，生存率低的独立预后指标。

　　6 小结

　　生存素因其在人类恶性肿瘤中过表达、高选择性分布、特殊的抗凋亡作用等特性，特别是在肿瘤治疗方面的潜在价值，引起国内外学者的关注。我们在生存素与消化道肿瘤的发生、发展和预后的密切关系方面已经有初步了解，但还有待更进一步的深入研究，特别是在针对生存素的抗肿瘤治疗的方面，以便为肿瘤的治疗开辟更广的前景。

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