RNA干扰分化抑制因子-1基因表达对食管鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响

　　作者：曾达武， 方明霞， 刘豫瑞 作者单位：福建医科大学 附属第一医院肝病中心，福州 350005

　　【摘要】 目的 研究针对分化抑制因子-1的siRNA(si-Id-1)对人食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞增殖和凋亡影响的可能机制。 方法 阳离子脂质体法介导si-Id-1转染ESCC TE-1细胞株，倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化并计算转染率，RT-PCR检测Id-1的mRNA表达水平;免疫印迹法检测Id-1的蛋白表达水平;细胞增殖实验检测转染前后TE-1细胞增殖能力变化;流式细胞术检测各组细胞的周期变化和凋亡指数。 结果 si-Id-1转染前后的TE-1细胞株Id-1的mRNA和蛋白表达水平有明显差异(P<0.05);转染后的TE-1细胞较其亲代细胞增殖能力降低，凋亡程度增强(P<0.05);转染后的TE-1细胞周期停滞在G0/G1期，G1期细胞数增多，S期细胞数减少(P<0.05)。 结论 利用脂质体将si-Id-1转染至ESCC的TE-1细胞是切实可行的;si-Id-1可以有效沉默TE-1细胞Id-1的表达，从而抑制ESCC细胞增殖。

　　【关键词】 抑制因子，免疫; 癌，鳞状细胞; 食管肿瘤; RNA，小分子干扰; 细胞凋亡; 细胞增殖

　　在我国，食管癌具有高发病率及高病死率，以手术为主辅以放射治疗或化学治疗的综合治疗可提高患者生存率，但仍有90%的患者死于转移和局部复发[1]，因此寻求新的切实有效的食管癌治疗方法或策略迫在眉睫。分化抑制因子(inhibitor of DNA binding or differentiation, Id-1)可在食管癌、肝癌等肿瘤中表达，参与肿瘤血管发生、促进肿瘤生长及转移[2-4];而小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)可有效沉默目标基因，而不影响正常基因[5]。该研究针对si-Id-1对人食管鳞状细胞癌(ESCC)TE-1细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响，探讨其对ESCC增殖和凋亡影响的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 Id-1-siRNA、Lipofectamine2000(广州锐博生物公司)，人食管鳞状细胞癌ESCC TE-1细胞(上海拜力生物公司，ATCC来源)，Trizol Reagent(美国Invitrogen公司)，RT-PCR试剂盒(美国Fermentas公司)，兔抗人Id-1多克隆抗体、Western印迹荧光试剂(美国Santa Cruz公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁株氏会社产品)，Taq酶(北京天庚生化公司)，Annexin V/PI凋亡试剂盒(美国Beckman公司)。

　　1.2 分组 空白对照组：正常培养TE-1细胞组;转染试剂组：仅加入Lipofectamine 2000组;转染对照组：转染非特异性序列NContml-05815的细胞组;转染实验组：转染si-Id-1组。

　　1.3 方法

　　1.3.1 TE-1细胞培养和脂质体介导的siRNA转染效率 ESCC TE-1细胞培养于含10%FBS的RPMI 1640培养液，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代。以105 mL-1的细胞密度接种培养，细胞80%融合后，用Lipofectamine 2000转染试剂进行转染。3组siRNA均由广州锐博生物公司设计与合成。

　　Si-Id-1-001(19 bp)：

　　5'-UGA GCA AGG UGG AGA UUCU dTdT-3'

　　3'-dTdT ACU CGU UCC ACCU CUA AGA-5'

　　Si-Id-1-002(19 bp)：

　　5'-CAU GAA CGG CUG UUA CUC A dTdT-3'

　　3'-dTdT GUA CUU GCC GAC AAU GAGU-5'

　　Si-Id-1-003(19 bp)：

　　5'-GUU GGA GCUGAA CUC GGAA dTdT-3'

　　3'-dTdT CAA CCU CGA CUU GAG CCUU-5'

　　另外，本实验还将标记FAM的siRNA同时转染至TE-1细胞，分别于转染6，24，48和60 h后通过荧光倒置显微镜观察含有荧光的细胞所占比例以及转染前后的细胞形态变化，据此估计siRNA的转染效率。

　　1.3.2 RT-PCR检测Id-1的mRNA表达 用Trizol一步法提取TE-1细胞总RNA，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测纯度并定量。然后以mRNA为模板，Oligo(dT)18为引物，逆转录成cDNA，反应总体积为20 μL，RT-PCR反应条件为42 ℃孵育60 min，70 ℃中止10 min。Id-1的PCR反应引物由上海生物工程公司设计和合成，扩增片段大小为416 bp。

　　上游引物(Id1-P1)：

　　5'-CAG CAC GTC ATC GAC TAC ATC A-3'

　　下游引物(Id1-P2)：

　　5'-GAA TCC CAC CCC CTA AAG TCT C-3'

　　以β-肌动蛋白(β-actin)的一段扩增序列为内对照，扩增片段大小为556 bp。

　　上游引物(β-actin-P1)：

　　5'-AAA GAC CTG TAC GCC AAC ACAG-3'

　　下游引物(β-actin-P2)：

　　5'-TTT TAG GAT GGC AAG GGA CTT C-3'

　　反应体系：1×PCR Buffer，dNTP 0.2 mmol/L，cDNA模板200 ng，引物浓度0.4 μmol/L，Taq酶1.25 U，反应总体积25 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s→57 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，共30个循环;72 ℃最后延伸7 min。最后的PCR扩增产物用凝胶图像分析系统进行灰度扫描。

　　目的基因的表达指数=目的基因条带的积分密度值/内对照条带的积分密度值

　　1.3.3 Western blot法检测Id-1的蛋白表达 siRNA转染TE-1细胞60 h后以RIPA缓冲液4 ℃裂解30 min，离心，取上清并采用BCA进行蛋白定量。各组采用同样的蛋白量上样，在SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后转膜，封闭液封闭1 h，加Id-1抗体(1∶1 000)4 ℃过夜，洗去未结合的一抗，以Western blot试剂盒加二抗DAB染色。

　　1.3.4 转染前后ESCC细胞的增殖 siRNA转染TE-1细胞在37 ℃，体积分数为0.05的CO2的培养箱内培养，24，48和72 h分别停止孵育，并向相应的培养板孔内加入10 μg/L的CCK-8溶液10 μL，继续培养2～4 h。酶标仪在450 nm的波长条件下测定各孔吸光度值。

　　细胞生长抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值

　　1.3.5 流式细胞技术检测细胞周期和凋亡 siRNA转染TE-1细胞48 h，胰酶消化并收集各组细胞，离心，弃上清，PBS洗涤，加缓冲液使其浓度为1×106 mL-1，取100 μL细胞悬液于5 mL流式管中，加入Annexin V/FITC 5 μL和20 μg/mL的碘化丙啶溶液10 μL，混匀后于室温避光孵育15 min，在反应管中加400 μL PBS，用WinMDI 2.9对结果进行分析处理。

　　1.4 统计学处理 每组实验均重复3次，实验数据以x±s表示，用SPSS 15.0软件分析。单因素方差分析采用q检验，以P<0.05表示差别有统计学意义。福建医科大学学报 2009年11月 第43卷第6期曾达武等：RNA干扰分化抑制因子-1基因表达对食管鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响

　　2 结 果

　　2.1 Id-1 siRNA转染至TE-1细胞后Id-1 mRNA的表达 转染后24～48 h含绿色荧光的细胞数最多，60 h后含绿色荧光的细胞数逐渐减少，提示TE-1细胞转染时间为24～48 h(图1)。通过荧光标记FAM的阳性对照转染效率，可预测本实验siRNA的转染效率>80%。RT-PCR聚丙烯酰胺电泳及凝胶图像分析系统灰度扫描结果均提示，空白对照组、转染试剂组和转染对照组Id-1 mRNA均存在表达，但各组间差别无统计学意义;3组转染实验组Id-1 mRNA的表达水平明显降低，灰度扫描值与空白对照组比较差别有统计学意义(P<0.05,图2，表1)。3条序列在转染后48 h均发挥明显的Id-1基因的沉默效应，尤以si-Id-1-001最为明显。

　　2.2 Id-1 siRNA转染至TE-1细胞后Id-1蛋白表达水平 转染组细胞Id-1蛋白表达明显低于空白对照组、转染试剂组和转染对照组。Image-ProPlus图像分析显示：si-Id-1组细胞Id-1完全不表达，与空白对照组比较差别具有统计学意义(P<0.05)(图3，表2)。

　　2.3 CCK-8法测定Id-1 siRNA干扰Id-1基因对TE-1细胞增殖的影响 转染后的24，48和72 h转染实验组细胞的吸光度值均显著低于空白对照组、转染对照组和转染试剂组(P<0.05)。表1 Id-1 RT-PCR平均灰度扫描比值表2 Id-1 Western blot平均灰度比值表3 不同时间点si-Id-1对TE-1细胞增殖的抑制

　　2.4 流式细胞技术检测TE-1细胞的细胞周期和细胞凋亡 与转染对照组、转染试剂组相比，转染实验组处于G0/G1期的细胞和处于S期的细胞比较差别均有统计学意义(P<0.05)。Annexin/PI双染法检测结果显示，空白对照组、转染对照组和转染试剂组的凋亡率较低，而转染实验组TE-1细胞的凋亡率为7.9%(P<0.05，表4)。表4 siRNA转染对TE-1细胞周期和凋亡的影响

　　3 讨 论

　　前期已对Id-1在ESCC组织中的表达作用做过研究，证实其具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡作用，是肿瘤发生、发展过程中的正调节蛋白[6]。而RNAi技术以其高稳定性、高效率性、高特异性及高传递性等特点，已成为肿瘤基因治疗的研究热点;靶基因的二级结构是影响siRNA沉默效率的主要因素之一，siRNA的干扰活性与其和靶基因mRNA的可结合性密切相关，针对靶基因的不同序列，siRNA的抑制作用差异很大[7-8]。

　　将根据RT-PCR结果优选出来的si-Id-1-001进一步进行转染，并检测各组蛋白的表达，从转染后Western blot的结果分析，发现转染组无Id-1蛋白表达，与对照组比较，差别具有统计学意义(P<0.05)，这与Li等的研究结果一致[9]。上述结果表明，利用脂质体人工合成的si-Id-1是可行和有效的，可能为研究Id-1对食管癌细胞生物学特性的影响及其作用机制提供一个可靠的工具。采用CCK-8试剂盒检测各组细胞的增殖能力，结果显示，转染24 h后si-Id-1组细胞增殖速度明显减慢，其增殖能力均受到抑制。可见，si-Id-1的瞬时转染能显著抑制ESCC细胞的增殖速度，这一结果与Hui等的研究一致[2]。经流式细胞监测转染后TE-1细胞的细胞周期，发现转染试验组转染48 h后G0/G1期细胞比例明显增加，S期细胞比例减少，由此可以推断si-Id-1可抑制人食管癌TE-1细胞从G0/G1期进入S期，导致G0/G1期阻滞，细胞不能进入S期合成DNA，从而达到抑制细胞快速增殖的作用。细胞增殖大多是由DNA合成的开始阶段细胞周期的G1/S所控制，这是阻断细胞增殖最关键的时相，siRNA有可能在G1/S期转换的决定性“检查点”抑制了TE-1细胞的进一步增殖，与Swarbrick及Zhang等的研究一致[10-11]。采用AnnexinV/PI双染凋亡细胞检测本实验中各组细胞凋亡指数，评价siRNA瞬时转染对TE-1细胞凋亡能力的影响。本研究发现ESCC TE-1细胞经si-Id-1转染48 h后凋亡率明显增加，说明体外RNAi技术下调Id-1基因表达，并对细胞凋亡起诱导作用。

　　Id-1靶向的siRNA通过抑制TE-1细胞Id-1 mRNA和蛋白表达水平，进而抑制TE-1细胞从G0/G1期进入S期，从而抑制TE-1细胞的快速增殖，诱导其凋亡。由此可见，Id-1基因可能参与TE-1细胞的增殖和凋亡，si-Id-1可能为抑制ESCC增殖提供一种基因治疗方法。然而，应用脂质体瞬时转染存在脂质体毒性、转染效率低、基因沉默效应短暂等不足，还需要构建带筛选标记的siRNA表达质粒，进行稳定转染，以获得较长时间的基因沉默效应和更为理想的干扰效果。通过体外实验优选出来的si-Id-1-001序列还有待进一步进行体内实验，以确定其是否能通过下调ESCC细胞Id-1的表达打断ESCC恶性变的进程，实现降低ESCC恶性度甚至逆转的目标，以期为临床治愈ESCC提供新的方法和思路。

　　【参考文献】

　　[1] Mariette C,Piessen G,Triboulet J P. Therapeutic strategies in esophageal carcinoma: role of surgery and other modalities[J]. Lancet Oncol, 2007,8(6):544-553.

　　[2] Hui C M,Cheung P Y,Ling M T, et al. Id-1 promotes proliferation of p53-deficient esophageal cancer cells[J]. Int J Cancer, 2006,119(3):508-514.

　　[3] Lee T K,Poon R T,Yuen A P, et al. Regulation of angiogenesis by Id-1 through hypoxia-inducible factor-1α-mediated vascular endothelial growth factor up-regulation in hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2006,12(13):6910-6919.

　　[4] 刘豫瑞,方明霞,曾达武. Id-1在肝细胞癌中的表达及其临床意义[J]. 福建医科大学学报, 2009,43(1):32-36.

　　[5] Bass B L. RNA intefrerence, the short answer[J]. Nature, 2001,411(6836):428-429.

　　[6] 刘豫瑞,庄则豪,李友炳, 等. id-1，ki-67及Bal-2在食管鳞癌中的表达及意义[J]. 中华消化内镜杂志, 2005,10(5):327-330.

　　[7] Davidson B L,Boudreau R L. RNA interference: a tool for querying nervous system function and an emerging herapy[J]. Neuron, 2007,53(6):781-788.

　　[8] Wesetrhout E M,Berkhout B. A systematic analysis of the effect of target RNA structure on RNA inetfrerence[J]. Nucleic Acids Res, 2007,35(13):4322-4330.

　　[9] Li B,Cheung P Y,Wang X, et al. Id-1 activation of PI3K/Akt/NF-kappa B signaling pathway and its significance in promoting survival of esophageal cancer cells[J]. Carcinogenesis J T- Carcinogenesis, 2007,28(11):2313-2320.

　　[10] Swarbrick A,Akerfeldt M C,Lee C S, et al. Regulation of cyclin expression and cell cycle progression in breast epithelial cells by the helix loop helix protein Id-1[J]. Oncogene, 2005,24(3):381-389.

　　[11] Zhang X M,Ling M T,Wang Q, et al. Identification of a novel inhibitor of differentiation-1 binding partner, caveolin-1, and its role in epithelial-mesenchymal transitionand resistance to apoptosis in prostate cancer cells[J]. J Boil Chem, 2007,282(46):33284-33294.