酒石酸锑钾对人胃癌细胞的生长抑制作用

　　作者：郭光云, 徐少勇, 邓长生, 王家宁, 黄永章 作者单位：郧阳医学院附属人民医院消化内科，湖北 十堰 442000

　　【摘要】 目的：观察酒石酸锑钾在体外对人胃癌SGC-7901细胞生长的影响及其作用机制的初步探讨。方法：采用MTT法检测不同浓度酒石酸锑钾对胃癌SGC-7901细胞生长的影响;用Hoechst 33 258染色后荧光显微镜观察药物作用后细胞的形态变化;流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果：MTT法显示酒石酸锑钾能明显抑制胃癌细胞生长，抑制作用呈时间和剂量依赖性;酒石酸锑钾作用后，Hoechst 33 258染色显示细胞核出现明显的凋亡形态学改变;流式细胞仪检测到凋亡峰，G2/M期细胞明显增多。结论：酒石酸锑钾能抑制SGC-7901细胞生长，有望用于肿瘤的治疗。

　　【关键词】 胃肿瘤

　　Inhibition of human gastric cancer cell proliferation induced by potassium antimonyl tartrate GUO Guang-yun,XU Shao-yong,DENG Chang-sheng,et al.(Department of Gastroenterology,Shiyan People's hospital ,Yunyang Medical College.Shiyan,hubei 442000)

　　Abstract:Objective To study the effects of potassium antimonyl tartrat on human gastric cancer cells(SGC-7901) and to explore its possible mechanism.Methods Human gastric carcinoma cell line SGC-7901 was cultured in vitro. Potassium antimonyl tartrate of different concentrations was added into the media.Cell without adding potassium antimonyl tartrate was used as control. The growth inhibition of cells induced by various concentration in different time course was analyzed by using MTT assay;The cell were stained by Hoechst33258 and the morphologic changes were observed under fluorescence microscope.The apoptosis peak of the cells and the changes of cell cycle were analysed using flow cytomtery.Rusult SGC-7901cells was inhibited obviously by potassium antimonyl tartrate;Chromatin condensation and nuclear fragmentation were seen under fluorescence microscope in the cells stained with Hoechst 33 258.Apoptosis peak were also detected by flow cytometry ,the percentage of G2/M cells increased significantly in the test group .Conclussion Potassium antimonyl tartrate significantly inhibits the proliferation of SGC-7901 cells.

　　Key words:potassium antimonyl tartrate; gastric neoplasms; apoptosis

　　胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，因其早期转移倾向和多药耐药现象，所以预后不佳。寻找新的方法治疗胃癌，延长患者的生存期，具有重要临床意义。最近的研究发现微摩尔浓度的锑剂(酒石酸锑钾、三氧化二锑)能显著抑制白血病细胞、恶性B淋巴细胞生长，而对正常的淋巴细胞无影响，被认为是一种潜在的、有价值的治疗血液系统恶性肿瘤的药物[1~3]。但锑剂对其它实体瘤细胞的作用尚不清楚，本文旨在探讨酒石酸锑钾对人胃癌细胞生长的影响及作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　酒石酸锑钾(potassium antimonyl tartrate,PAT)购自Sigma-adrich公司,用三蒸水配制成10 mmol/L的储存液。Hoechst 33 258、碘化丙啶(PI)、RNase购自Sigma公司;四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazo-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,MTT])购自北京华美公司;RPMI1640培养基、小牛血清购自Gibco公司;SGC-7901胃癌细胞株购自中科院上海细胞生物所。使用仪器：Olympus BX 51荧光显微镜、∑960酶标仪、Coulter Epics XL流式细胞仪。

　　1.2 细胞培养用RPMI 1640培养液(含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素)，在37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱中常规培养。取对数生长期的细胞用于实验。

　　1.3 MTT法检测细胞生长抑制率将SGC-7901胃癌细胞用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度为3×104 /ml，接种于96孔培养板，每孔加200 μl的细胞悬液,细胞培养24 h贴壁后，加入酒石酸锑钾。设立阴性对照组和不同酒石酸锑钾实验组(5、10、20、40 μmol/L)，每组均设立4个复孔。培养24、48、72 h每孔加入MTT(5 mg/ml,PBS配制)20 μl再培养4h，吸弃上清，加入二甲基亚枫(DMSO)200 μl，震荡10 min。于酶标仪490 nm处测量吸光度A值。上述实验重复3次，取其均值。计算细胞增殖的抑制率(Inhibitory Rate,IR)。IR=(1-实验组A值)/对照组A值×100%。

　　1.4 Hoechst 33 258染色观察细胞核的变化取指数生长期的细胞，以2×106/ml的密度接种于6孔板中,培养24 h细胞贴壁后加入酒石酸锑钾，设5、10、20 μmol/L作用浓度，同时设不加药物的阴性对照，24、48 h后吸尽培养液，加入0.5 ml固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)，固定10 min，去固定液，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline，PBS)洗两遍。加入0.5 ml Hoechst 33 258(5 μg/ml)染色液，染色5 min。紫外光激发,荧光显微镜观察并照相。

　　1.5 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡细胞处理同前。收集药物作用24、48 h后的细胞，PBS漂洗后,以70%乙醇4 ℃固定过夜，离心去乙醇，PBS漂洗，加入10 μg/ml的RNase于37 ℃消化0.5 h,加入50 μg/ml的PI于4 ℃染色1 h，流式细胞仪检测，采用Muticycle软件分析细胞周期。

　　1.6 统计学处理采用SPSS10.0软件处理系统进行统计分析,细胞生长抑制率用方差分析，组间两两比较用SLD法,两样本均数之间比较用t检验。

　　2 结果

　　2.1 酒石酸锑钾对细胞生长抑制作用5、10、20、40 μmol/L PAT作用于SGC-7901细胞24~72 h后，细胞的生长受到不同程度抑制。不同浓度的生长抑制率之间存在显著性差异(P<0.01);不同时间段的生长抑制率之间存在显著性差异(P<0.01)。LSD 法比较5、10、20、40 μmol/L PAT的生长抑制率两两之间的差异有显著意义(P<0.01)。PAT对SGC-7901细胞的抑制作用随药物浓度增大而增大，浓度由5、10、20 μmol/L增加到40 μmol/L，72 h后细胞的生长抑制率由19.5%、38.4%、54.1%增加到66.6%。PAT处理72 h与48 h或24 h、48 h与24 h后的生长抑制率之间差异有显著性意义(P<0.01)，PAT对SGC-7901细胞的抑制作用随用药时间延长而增大，40 μmol/L PAT作用24 h后细胞的生长抑制率为27.7%，48 h后增加为59.7%，72 h后达66.6%。由此可见，PAT对SGC-7901细胞的生长抑制作用具有时间效应和剂量效应关系(见图1) 。

　　2.2 形态学改变Hoechst 33 258染色后，在荧光显微镜下观察，见对照组细胞所发荧光较弱，较均匀;而经酒石酸锑钾作用24、48 h后的SGC-7901细胞出现核固缩，呈致密强荧光，DNA浓缩并向核膜靠拢，核浆比例减少，少数细胞核碎裂成块状(图2)。

　　2.3 流式细胞仪检测结果酒石酸锑钾以不同浓度作用于SGC-7901细胞,流式细胞仪检测凋亡细胞群,成特征性的亚二倍体峰,细胞凋亡率在48 h最高。酒石酸锑钾作用48 h后，各个浓度作用组G2/M期细胞均明显多于空白对照组，而G0/G1期细胞则减少，差异有显著性意义(P<0.05，见表1)。表1 不同浓度酒石酸锑钾作用48 h SGC-7901细胞凋亡率和周期分布

　　3 讨论

　　肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，同时也是细胞凋亡异常的疾病[5]。细胞凋亡不仅在肿瘤发生和发展中有重要意义,而且化疗、放疗和生物治疗都是主要通过诱导肿瘤细胞凋亡来治疗肿瘤[6~8]。胃癌是消化道常见的肿瘤，绝大多数胃癌患者在确诊后不同阶段均接受化疗。因此能否诱导胃癌细胞凋亡及诱导能力的强弱，便成为筛选新的胃癌化疗药的重要指标之一[9]。

　　MTT法测定原理是活细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶可将MTT还原为蓝紫色的甲瓒颗粒，甲瓒产量与活细胞数成正比。该方法误差小，且较准确，目前广泛用于活细胞检测及药物敏感检测。本实验发现不同浓度及不同时间段的生长抑制率之间有显著性差异(P<0.01)。LSD 法比较5、10、20、40 μmol/L酒石酸锑钾的生长抑制率两两之间的差异有显著意义(P<0.01)，PAT对SGC-7901细胞的抑制作用随药物浓度增大而增大，浓度由5、10、20 μmol/L增加到40 μmol/L，72 h后细胞的生长抑制率由19.5%、38.4%、54.1%增加到66.6%。酒石酸锑钾处理72 h与48 h或24 h、48 h与24 h后的生长抑制率之间差异有显著性意义(P<0.01)，酒石酸锑钾对SGC-7901细胞的抑制作用随用药时间延长而增大。酒石酸锑钾能明显抑制体外培养的SGC-7901细胞的生长，其抑制作用具有时效和量效关系。

　　为了进一步探讨酒石酸锑钾抑制SGC-7901细胞生长的机理，我们检测了其凋亡情况及细胞周期的分布。Hoechst33258染色荧光显微镜下显示,细胞核明显变小，呈致密强荧光，有的裂解成碎片等典型细胞凋亡形态学改变。流式细胞仪检测可见凋亡细胞形成的亚G1峰，其凋亡率与药物浓度成正比，提示呈剂量依赖性诱导细胞凋亡，从而抑制细胞生长。流式细胞仪检查发现，酒石酸锑钾也使细胞周期分布发生明显变化。酒石酸锑钾作用48 h后，G2/M期细胞增加，G0/G1期细胞减少。细胞阻滞于G2/M期而使细胞周期进程受阻，影响细胞有丝分裂，从而抑制细胞生长。推测酒石酸锑钾抑制细胞生长可能与其能使细胞阻滞于G2/M期和诱导细胞凋亡有关。但其使细胞阻滞于G2/M期和诱导细胞凋亡是因果关系或是伴随关系，尚需进一步研究。

　　综上所述，酒石酸锑钾可抑制SGC-7901细胞生长，其机理可能与干扰细胞周期和诱导凋亡有关。在治疗寄生虫感染中，观察到其主要副作用是心脏毒性，但心脏毒性主要是在剂量较大时出现[1]。本试验发现极低浓度的酒石酸锑钾，就可以抑制胃癌细胞生长，诱导胃癌细胞凋亡。这种浓度的酒石酸锑钾用来治疗血吸虫病，机体能耐受而无明显副作用[1]。因此，酒石酸锑钾有望用于胃癌治疗，但抑制胃细胞所需的浓度对正常组织有无影响，以及在体的治疗效果，有待进一步研究。

　　【参考文献】

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　　[4] 于文强，孙秉中，柴玉波,等.不同锑剂对早幼粒细胞白血病凋亡诱导作用比较[J] .第四军医大学学报,2003,24(4):335-338.

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　　[9] 马 韬，朱正刚.胃癌化疗与细胞凋亡研究进展[J] .国外医学消化系统分册,2003,23(1):15-18.