15脂氧合酶1在胃癌细胞AGS中的表达

　　作者：林芬， 李建英， 陈丰霖， 陈治新， 王小众 作者单位：福建医科大学 附属协和医院消化内科，福州 350001

　　【摘要】 目的 研究15脂氧合酶1(15LOX1)基因在人胃癌细胞AGS中的表达及其对AGS增殖凋亡的影响。 方法 通过脂质体介导瞬时转染15LOX1基因于培养的AGS中，逆转录PCR法和免疫印迹法检测15LOX1 mRNA及蛋白表达;四甲基偶氮唑盐法(MTT)、流式细胞术、AnnexinV/PI染色与原位末端标记法(TUNEL)比较转染前后AGS的增殖和凋亡情况。 结果 胃癌细胞AGS转染后表达有15LOX1的mRNA及蛋白。与非转染组及空质粒转染组相比较，转染重组质粒组AGS细胞生长明显受到抑制并且细胞周期停滞在G1期，其凋亡率明显高于非转染组及空质粒转染组。 结论 15LOX1基因能够抑制胃癌细胞AGS的增殖，并促进其凋亡。

　　【关键词】 花生四烯酸盐15脂氧合酶; 胃肿瘤; 肿瘤细胞，培养的; 细胞增殖; 细胞凋亡

　　15脂氧合酶1(15lipoxygenase1,15LOX1)是脂氧合酶同工酶的一种，是机体催化花生四烯酸生成活性分子从而影响细胞信号传导及代谢的关键酶，能够调节恶性肿瘤特别是上皮性肿瘤的存活。为了解15LOX1基因与胃癌的关系，本实验采用体外细胞系基因转染法，研究15LOX1基因转染对胃癌细胞增殖及凋亡的影响，以探讨该基因与胃癌发生发展的关系及作为基因治疗的候选基因的可能性。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂 重组15LOX1真核表达载体pcDNA3.1(+)/15LOX1由NIH的Eling博士惠赠，pcDNA3.1(+)表达载体由福建临床免疫研究所郑祥雄教授惠赠。质粒抽提试剂盒、逆转录试剂盒，脂质体转染试剂盒均购自美国Promega公司;RNA抽提试剂盒和AnnexinV/PI凋亡试剂盒购自深圳生物晶美公司;山羊抗人15LOX1多克隆抗体购于Santa cruz公司(sc27354)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组pcDNA3.1(+)/15LOX1质粒转染AGS细胞 AGS细胞生长于含10%小牛血清的RPMI 1640中，以脂质体转染的方法分别将pcDNA3.1(+)/15LOX1、pcDNA3.1(+)质粒转入细胞中，命名为AGS/15LOX1、AGS/pcDNA3.1细胞。步骤如下：选取对数生长期细胞，消化接种于25 cm×25 cm培养瓶，细胞数为1×106 L-1，待细胞贴壁，取无菌试管加入37 ℃预热的无血清培养基2 mL，DNA 5 μg，TransFast Reagent 15 μL，立即涡旋混匀，室温下静置10～15 min。小心吸出培养细胞的培养基，稍涡旋混匀脂质体/DNA混合物，加入培养瓶中，37 ℃孵育1 h，加入含血清的培养基4 mL，37 ℃继续孵育48 h。

　　1.2.2 逆转录PCR法(RTPCR)鉴定15LOX1基因在转染细胞中的表达 分别抽提未转染AGS，AGS/pcDNA3.1,AGS/15LOX1 三组细胞总RNA，取RNA样品2 μg，42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min进行逆转录合成cDNA。

　　15LOX1引物(485 bp)

　　上游：5'GCTGGAAGAGAGAAGGAAGTTG3'

　　下游：5'GAAGTCAGCTTCGAACAGTGTG3'

　　内参βactin(776 bp)

　　上游：5'CTATTGGCAACGAGCGGTTC3'

　　下游：5'CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT3'

　　取1 μL cDNA进行PCR扩增(反应体系25 μL)。扩增条件：94 ℃ 3min→94 ℃ 45 s→57 ℃ 45 s→72 ℃ 1 min，25个循环;72 ℃ 7 min。取8 μL PCR 产物，经1.2%琼脂糖凝胶(含0.5 g/L溴化乙锭)中电泳分离,紫外灯下观察结果。

　　1.2.3 免疫印迹法(Western Blot)分析15LOX1蛋白在转染细胞中的表达 提取转染前后细胞总蛋白样品，Bradford比色法测定蛋白浓度。每孔25 μg蛋白上样,10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白印迹包括电转膜、5%脱脂奶粉封闭、一抗(1∶100)4 ℃过夜、二抗(1∶5 000)室温轻摇60 min,用化学发光试剂盒进行蛋白信号检测。设βactin作为内对照。

　　1.2.4 MTT法检测15LOX1对AGS细胞增殖的影响 250 mg MTT溶解于50 mL PBS(0.01 mol/L pH 7.4)，过滤，4 ℃避光保存备用。将AGS细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640稀释成1×104 mL-1，接种于96孔培养板，分别于培养24，48，72，96 h加入MTT 20 μL，继续培养4 h，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，至结晶充分溶解，用酶标仪检测在波长490 nm处吸光度D值，设只加培养液，不加细胞的空白对照孔调零，每组设8个复孔，取其均值。以时间(t)为横轴,吸光度D值为纵轴绘制细胞生长曲线，按下面的公式计算:

　　细胞存活率=D实验孔/D对照孔×100%

　　1.2.5 流式细胞仪分析检测细胞周期和细胞凋亡 AGS细胞PBS洗1次，收集并调整细胞浓度为1×106 mL-1,70%乙醇固定，4 ℃保存;去除固定液，加200 μL RNase A 37 ℃水浴30 min，PI染色4 ℃避光30 min，上机,观察G1期、S期和G2期细胞各占百分比。AGS细胞用1×缓冲液洗1次，取490 μL缓冲液重悬细胞并调整浓度为(2～5)×105 mL-1,加入AnnexinV 5 μL、PI 5 μL，混匀，室温避光15 min，上机，分析正常细胞、凋亡细胞和死亡细胞的百分率。

　　1.2.6 原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡 具体步骤按试剂盒操作说明。光学显微镜下计数测得凋亡细胞数，得出阳性细胞百分数为细胞凋亡指数(AI)。

　　1.3 统计学处理 应用SPSS 12.0统计软件。计量资料应用t检验、方差分析法进行分析，计数资料应用卡方检验及确切概率法进行分析。P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 转染后胃癌细胞AGS存在15LOX1 mRNA的表达 PCR扩增结果显示，转染pcDNA3.1(+)质粒的细胞和非转染组均未检测出15LOX1 mRNA的表达，而转染pcDNA3.1(+)/15LOX1的实验组AGS细胞在500 bp处扩增出相应的片断(图1)。

　　2.2 转染后胃癌细胞AGS中存在15LOX1蛋白的表达 转染pcDNA3.1(+)质粒的细胞及非转染组均未检测出15LOX1蛋白的表达，AGS/15LOX1细胞中可见15LOX1蛋白表达(图2)。

　　2.3 转染15LOX1基因后AGS细胞增殖受到抑制 与转染pcDNA3.1(+)/15LOX1载体的胃癌细胞AGS/15LOX1组比较，24 h 3组活细胞数比较差别无统计学意义(P>0.05)，48 h后开始出现差异(P<0.05)，AGS/15LOX1组的活细胞数较同M:marker;1:AGS/15LOX1;2:AGS/pcDNA3.1;3:AGS.期的对照组AGS及空质粒转染组AGS/pcDNA3.1低，并且这种差异随时间的延长而越来越显著,转染后24 h细胞存活率为98.86%;48 h为72.07%;72 h为64.53%;96 h为43.27%(图3)。

　　2.4 转染15LOX1基因对AGS细胞周期的影响 15LOX1可引起AGS细胞周期分布发生明显的改变：DNA合成前期(G0/G1)细胞明显增加，DNA合成期(S期)细胞则相应减少。分析显示，15LOX1转染组G0/G1期、S期与对照组存在明显差异(P<0.05)(图4，表1)。A:AGS; B:AGS/pcDNA3.1; C:AGS/15LOX1.表1 15LOX1对胃癌细胞AGS细胞周期的影响

　　2.5 转染15LOX1基因对AGS凋亡的影响 转染15LOX1基因组AGS/15LOX1的凋亡细胞百分率为(16.07±2.13)%，而转染空质粒组AGS/pcDNA3.1与未转染组分别为(1.73±0.29)%和(1.27±0.34)%。AGS/15LOX1组分别同AGS/pcDNA3.1与未转染组AGS进行比较，差别有统计学意义(P<0.01，图5)。

　　2.6 转染15LOX1基因AGS细胞的凋亡 阳性细胞核染成深棕色。对照组细胞大小比较一致，凋亡细胞所占比例很少;转染重组质粒pcDNA3.1/15LOX1后,有部分AGS细胞核呈深棕色着染，核固缩，不规整且大小不一致。对照组AGS，转染空质粒组AGS/pcDNA3.1细胞凋亡指数为(5.30±1.09)和(8.16±2.36)，2组比较差别无统计学意义(P>0.05),而转染15LOX1基因组AGS/15LOX1凋亡率为(26.69±2.17)%，与前2组比较差别有统计学意义(P<0.01，图6)。

　　A:AGS,细胞核呈淡蓝紫色着染,核形态大小比较一致,未见凋亡细胞; B:AGS/pcDNA3.1,偶见深棕色深染的AGS,凋亡细胞较少; C:AGS/15LOX1,凋亡的AGS深棕色着染,核固缩,不规整,大小不一致.

　　3 讨 论

　　胃癌是我国主要恶性肿瘤之一，其具体发病机制仍不明确。随着对肿瘤的深入研究，花生四烯酸代谢与肿瘤的关系已经日益引起人们的关注。花生四烯酸代谢主要包括两条途径，即环氧合酶途径和脂氧合酶途径。脂氧合酶按其氧化部位不同可分为5，8，12，15LOX。目前人们较为认可5LOX、8LOX和12LOX具有促癌作用，而15LOX因其在肿瘤中的作用备受争议，近年来广受关注。15LOX基因定位于第17号染色体的p13.3亚带，包含14个外显子，根据其组织分布的特异性分为两种同工酶15LOX1、15LOX2[1]。大多数研究认为，15LOX1在结肠癌、食道癌、乳腺癌等肿瘤细胞中表达较正常组织明显下降甚至缺失，表现为抑癌作用[24]。在结肠癌中，15LOX1蛋白表达水平与结肠癌的分化程度呈负相关。有研究表明，15LOX1在结肠癌中能够抑制COX2途径的促癌作用;并且，结肠癌细胞Caco2检测不出15LOX1蛋白的表达，应用15LOX1诱导剂或基因调节等方法上调15LOX1的表达可抑制肿瘤细胞的增殖，促进其凋亡;15LOX1表达还可增强结肠癌对NSAIDS的敏感性，促进NSAIDS的诱导凋亡作用[58]。但在前列腺癌中，15LOX1的表达较正常增高，并与前列腺癌Gleason评分呈正相关，因此表现出促癌作用[9]。有研究通过构建过度表达15LOX1转基因大鼠，证明15LOX1能够促进大鼠前列腺上皮肿瘤的增殖[10]。这也进一步明确了15LOX1在前列腺癌中的促癌作用。但15LOX1在胃癌中究竟是促癌还是抑癌?笔者前期实验研究发现，15LOX1 mRNA及蛋白在胃癌组织中的表达均显著低于癌旁正常组织。15LOX1蛋白表达水平与胃癌中肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期呈明显的负相关[11];Wu等运用COX2抑制剂SC236能够诱导胃癌细胞MKN45，MKN28，AGS中15LOX1及其产物13HODE表达从而促进肿瘤细胞凋亡，且该作用独立于抑制COX2途径之外[12]。表明15LOX1可能在胃癌中发挥抑癌作用。

　　本实验发现，非转染组AGS及空质粒转染组AGS/pcDNA3.1的活细胞数随着培养时间的延长逐步增多,生长速度相当快,呈对数生长趋势，而重组质粒AGS/15LOX1组的细胞随时间延长而增殖延缓，生长速度落后于其他2组，并且这种差异随时间的延长而越来越显著,培养至第96小时，细胞数量约为对照细胞的43.27%;而且其细胞周期G0/G1期细胞比率明显增加，S期细胞比率明显减少,出现G1期阻滞现象。表明转染外源性15LOX1对AGS的增殖有明显的抑制效应;并证实转染重组质粒PCDNA3.1/15LOX1可促进胃癌细胞AGS的凋亡。但与AnnexinV/PI法检测的细胞凋亡率比较，TUNEL法检测的实验组凋亡率略高，估计与TUNEL法利用DNA聚合酶和末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)来标记DNA链断端的核酸，应用TdT进行的末端反应将有DNA链断端的细胞着色，无法区别凋亡与坏死，故存在一定的假阳性率有关。但由于本研究采用脂质体介导的基因转染的效率较低，如果提高基因转染的效率，其对AGS增殖抑制率与凋亡率也可能会相应提高。

　　根据以往的研究，运用5LOX抑制剂AA861能抑制胃癌细胞AGS增殖并诱导其凋亡，故推测其主要通过影响5LOX的催化活性和减少5LOX途径代谢产物的含量而影响AGS的活性;采用12LOX抑制剂黄芩素干预AGS细胞，发现12LOX对PKC 活性具有调节作用，PKC参与了12LOX影响胃癌细胞增殖凋亡的信号传导[1314]。本实验通过转染15LOX1基因实现胃癌细胞AGS的增殖减少、凋亡增加，初步明确其在胃癌中的抑癌作用。但15LOX1调节肿瘤存活机制尚无较统一结论。Kim等认为，15LOX1(不包括13HODE)可直接经由DNA依赖性蛋白激酶途径磷酸化P53，上调细胞周期蛋白激酶抑制剂P21、MDM2等基因表达，从而抑制肿瘤细胞生长[15];也有报道，15LOX1及其代谢产物13HODE作为PPAR的配体，能够通过下调PPARβ/δ并活化PPARγ，致癌细胞凋亡[16]。另有研究表明，15LOX促进分化、抑制生长及诱导凋亡的作用与其他LOX的促癌作用之间存在动态平衡[17]。本研究下一步将就15LOX1对胃癌细胞生物学行为的影响及其作用机制进行更进一步的探讨，为未来进行胃癌基因治疗奠定实验基础。

　　【参考文献】

　　[1] Brash A R. Lipoxygenases: occurrence,functions,catalysis and acquisition of substrate[J]. J Biol Chem, 1999，274(34):2367923682.

　　[2] Xu X C,Shappel S B,Liang Z,et al. Reduced 15slipoxygenase expression in esophageal cancer specimens and cells and upregulation in vitro by the cyclooxygenase1inhibitor,NS398[J]. Neoplasia, 2003,5(2):121127.

　　[3] Heslin M J,Hawkins A,Boedefeld W,et al. Tumorassociated downregulation of 15lipoxygenase1 is reversed by celecoxib in colorectalcancer[J]. Ann Surg, 2005,241(6):941946.

　　[4] Jiang W G,Watkins G,DouglasJones A,et al. Reduction of isoforms of 15lipoxygense(15LOX)1 and 15LOX2 in human breast cancer[J]. Prostaglandins,Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 2006,74(4):235245.

　　[5] Yuri M,Sasahira T,Nakai K,et al. Reversal of expression of 15lipoxygenase1 to cyclooxygenase2 is associated with development of colonic cancer[J]. Histopathology, 2007,51(4):520527.

　　[6] Shureiqi I,Wu Y,Chen D,et al. The critical role of 15Lipoxygenase1 in colorectal epithelial cell terminal differentiation and tumorigenesis[J]. Cancer Res, 2005,65(24):1148611492.

　　[7] His L C,Xiaopei X,Lotan R,et al. The histonedeacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid induces apoptosis via induction of 15lipoxygenase1 in colorectal cancer cells[J]. Cancer Res, 2004,64(23),87788781.

　　[8] Yoshinaga M,Murao H,Kitamura Y,et al. The 15lipoxygenase1 expressionmay enhance the sensitivity to nonsteroidal antiinflammatory druginduced apoptosis in colorectal cancers from patients who are treated with the compounds[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2007,22(12),23242329.

　　[9] Hsi L C,Wilson L C,Eling T E,et al. Opposing effects of 15lipoxygenase1 and 2 metabolites on MAPK signaling in prostate:alteration in PPARg[J]. J Biol Chem, 2002,277(43):4054940556.

　　[10] Kelavkar U,Parwani A,Shappell S,et al. Conditional expression of human 15lipoxygenase1 in mouse prostate induces prostatic intraepithelial neoplasia:the FLiMP mouse model[J]. Neoplasia, 2006,8(6):510522.

　　[11] 李 勇，李建英，陈丰霖,等. 15脂氧合酶1在胃癌中的表达及其临床意义[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2006,15(6):576580.

　　[12] Wu J,Xia H H,Tu S P,et al. 15Lipoxygenase1 mediates cyclooxygenase2 inhibitorinduced apoptosis in gastric cancer[J]. Carcinogenesis, 2003,24(2):243247.

　　[13] 邹来玉，李建英，王小众,等. AA861对人胃癌细胞凋亡及5脂氧合酶mRNA表达的影响[J]. 福建医科大学学报, 2006,40(1):1418.

　　[14] 陈丰霖,王小众,李建英,等. 12脂氧合酶影响胃癌细胞株AGS蛋白激酶C活性[J]. 福建医科大学学报, 2007,41(2):131133.

　　[15] Kim J S,Baek S J,Botton F G,et al. Overexpression of 15lipoxygenase1 induces growth arrest through phosphorylation of p53 in humancolorectal cancer cells[J]. Mol Cancer Res, 2005,3(9):511517.

　　[16] Zuo X,Wu Y,Morris J S,et al. Oxidative metabolism of linoleic acid modulates PPARbeta/delta suppression of PPARgamma acivity[J]. Oncogene, 2006,25(8):12251241.

　　[17] Spanbroek R,Hildner M,Kohler A,et al. IL4 determines eicosanoid formation in dendritic cells by downregulation of 5lipoxygenase and upregulation of 15lipoxygenase1 expression[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98(9):51525157.