肝癌细胞侵袭转移分子机制研究进展

　　作者：李贞 作者单位：中国人民解放军总医院消化科，北京 100853

　　【关键词】 原发性肝癌

　　原发性肝癌(肝癌)主要是肝细胞癌(hePatocelluar　carcinoma，HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，病死率高，复发转移是影响预后的最主要因素。据报道，HCC根治性切除后5年复发率为 54.1%～61.5%，小肝癌(≤5cm)为43.5%，而局部治疗的转移复发率更高。因此抗 HCC侵袭转移，减少术后复发成为目前研究的热点和难点。本文就目前国内外肝癌细胞侵袭转移分子机制做一综述。

　　肿瘤侵袭和转移，是瘤细胞从原发瘤脱离后向周围和(或)远处组织运动的过程，涉及瘤细胞穿过细胞外基质(extracellular matrix, ECM)屏障、血管壁的基底膜(basement membrane,BM)及穿出血管壁进人宿主微环境等环节，分为3步:粘附，降解，移动。

　　1 粘附

　　在HCC的侵袭转移过程中存在多种细胞粘附分子异常表达，其中以钙粘素(cadherin, Cad)、连接素(catenin, Cat)和CD44最为重要。上皮钙粘蛋白(E-cadherin)是一组钙离子依赖性跨膜糖蛋白，主要介导同型细胞间的粘附作用，广泛分布在成年组织的上皮细胞中，是维护上皮细胞形态、结构的完整性、极性的重要分子，起细胞骨架作用。研究表明E-cadherin表达下调有利于肿瘤细胞脱离原发灶发生转移[1]。其机制可能是转录或转录后减量调节(transcriptional or posttranscriptional down-regulation )，同时E-cadherin在HCC中的表达下降程度与肝癌组织学分级呈负相关，且低表达水平的E-cadherin提示患者生存率低，预后不佳。E-cadherin相关蛋白catenin(包括α-catenin ,β-catenin , γ-catenin)在HCC中呈过表达，且在分化程度越低的HCC中其表达水平越高。β-catenin常与E-cadherin结合，形成细胞内的粘着复合体(cadherin catenin comPlex,CCC)，对维持细胞的正常粘附和信号转导功能是必需的，而且CCC分布在膜下细胞与细胞连接处，当细胞发生癌变时，这些分子在细胞内的表达和分布发生异常，即发生转位。而β-catenin的表达和定位与HCC的肝内转移、门静脉浸润的关系有不同的研究结果，Endo等[2]通过对107例手术切除下的肝癌组织研究中发现β-catenin在细胞膜过度表达，并与血管浸润程度呈正相关;而Fujito等[3]认为在胞核表达的β-catenin与HCC的血管浸润程度呈正相关，其核型表达可作为HCC预后的指标。CD44分子是具有高度异质性的单链膜表面糖蛋白，主要配体为ECM中的透明质酸(HA)、胶原蛋白等，参与细胞与基质间的特异性粘附。CD44存在标准型(CD44s)和变异型(CD44v)，前者主要存在于正常细胞和非转移性癌细胞中，而后者则常在转移性癌细胞中显著表达。Endo等[4]发现CD44v6的高表达与经血管侵袭及p53基因的过表达密切相关。同时发现CD44表达程度与肝癌分化程度相关，分化程度越低，CD44表达水平越高。应用Kaplan-Meiur生存分析曲线分析，在肝癌组织中越多CD44亚型(包括CD44s 、CD44v5、CD44v6、CD44v7-8、CD44v10)表达呈阳性，则患者的生存率越低，表明高表达的CD44亚型与低分化肝癌及较低生存率有关。而Barbour等[5]通过转染全长的CD44v2-10，发现转染了CD44v2-10的癌细胞在SCID小鼠中导致了肺部转移，但对原发肿瘤的发展没有造成影响，并在体外发展CD44可显著改变细胞的粘附力。

　　2 降解

　　肿瘤细胞释放各种蛋白水解酶，破坏其粘附部位的组织，即必须破坏ECM和BM，实现浸润转移与新生血管形成。在这一过程中尿激酶型纤溶酶原激活物(urokiuase-type plasminogen activator,uPA)及其抑制剂(plasminogen activation inhibitor，PAI)，基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinasas,MMPs)及其抑制剂(tissue inhibits of metalloproteinases,TIMPs)发挥重要作用。

　　2.1 uPA-uPAR-PAI系统 uPA是丝氨酸蛋白水解酶，在组织中以无活性的酶原形式存在(Pro-uPA)，肿瘤细胞分泌的Pro-uPA与细胞膜或间质中的uPA特异性受体(uPR)结合，被激活为双链活化形式，然后使纤溶酶激活，引起ECM和BM降解。PAI是纤溶酶活性抑制剂，近来研究提示其在细胞的信号转导、细胞粘附以及细胞的迁移中起着重要的作用，并与uPA,uPAR一起共同参与肿瘤的浸润与转移过程。uPA/uPAR介导的纤溶降解效应主要是在肿瘤侵袭初始，即突破BM屏障过程中起关键作用。Zhou等[6]应用免疫组化的方法测定uPA、uPAR、PAI-1、PAI-2在HCC中的阳性率分别为78.9 % 、 68.4% 、57.9 %、31.6%。应用ELISA方法，uPA、 uPAR、 PAI-1在HCC组和对照组的表达水平有显著性差别，而PAI-2在这2组中的水平则无显著性差别，表明在纤溶酶系统中uPA 、 uPAR 、 PAI-1与HCC侵袭有关。另有研究指出，在HCC中uPA及PAI-1呈过表达，尤其在有门静脉癌栓、侵袭转移的肝癌组织中，其表达水平明显高于癌旁组织及对照组。同时在肿瘤组织和癌栓中uPA及PAI-1的mRNA均表达增强。在uPA、uPAR和PAI-1均阳性的癌肿中，其转移性和移动性更强[7]。Itoh等[8]研究指出，在纤溶酶系统中uPA的活性是影响肝癌侵袭的最敏感的因素，是肝癌复发的一个较强的预测指标，提出当uPA活性超过0.70ng/mL就应该密切随访，注意肝癌复发的可能性。

　　2.2 MMPs与TIMPs系统 MMPs是一组先由细胞分泌，而后又在细胞外获得活性的锌离子依赖性酶，MMPs具有高度的同源性。迄今为止至少发现有19种之多，按作用底物不同主要分为五大类:(1)胶原酶:包括间质胶原酶(MMP-1)、中性粒细胞胶原酶(MMP-8)和Ⅲ型胶原酶(MMP-13)。主要降解I、II,Ⅲ型等多种类型间质胶原和蛋白多糖的核心蛋白。(2)明胶酶(Ⅳ型胶原酶):包括明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)，降解明胶和Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型基底膜胶原。(3)基质降解素(间质溶素):分1,2,3与matrilysin(MMP-3、-10、-11、-7)型，降解弹性纤维、纤维连接蛋白、层粘蛋白等基质糖蛋白和蛋白多糖的核心蛋白。(4)膜型基质金属蛋白酶(MT-MMP):包括MT1-MMP(MMP-14)、MT2-MMP(MMP-15)、MT3-MMP(MMP-16)、MT4-MMP(MMP-17)，除能降解ECM外，也能活化其他MMPs，主要为MMP-2胶原。(5)其他酶类(MMP-12 ,-18 ,-19):作用不详。它们维系着ECM的平衡。肿瘤的发展过程中MMPs和TIMPs的表达平衡变化，影响着其侵袭和转移。两者表达的失衡影响了基质的降解，而基质的降解与否与肿瘤细胞的迁移，胞外基质的重构，新生血管的形成密切相关。研究表明肝细胞癌组织中MMP-2及MMP-9均有过度表达，并与肿瘤转移相关密切[9]。而上调的TIMPs表达抑制肿瘤细胞的侵袭与转移，同时也可以通过抑制肿瘤新生血管的形成起到抑制肿瘤生长作用。

　　3 移动

　　水解酶类破坏粘附部位组织，使肿瘤细胞得以向纵深移动，朝远距离转移。一般说来，具有高度侵袭转移能力的肿瘤细胞往往同时也具有活跃的细胞运动能力。细胞的迁移运动与肌动蛋白-肌球蛋白及其相互作用有关，是信号传导所介导的细胞骨架重组的结果。Rho基因家族通过编码一类与Ras同源的小GTP结合蛋白而介导细胞内外信号的传导。近年来研究发现,RhoC GTP酶的过量表达与肿瘤的侵袭转移密切相关。其机制可能与其调控肌动蛋白细胞骨架的迁移而影响肿瘤细胞的侵袭和转移。Genda等[10]将5种HCC细胞株转染人裸鼠的肝脏中，构建肝癌转移模型。其中导入的Li7和KYN-2细胞导致血管瘤栓和肝内转移，在体外，它们的细胞移动性明显比其他3种高。这种细胞高移动性是通过Rho介导血清和溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)激活肌动蛋白重组。P160ROCK(P160 Rho-associated coiled-coil forming protein kinase)是一种Rho相关的丝-苏氨酸蛋白激酶，在Li7细胞中转染入活化的p160ROCK，可不依赖于血清和LPA而提高细胞移动性;转染入失活的p160ROCK则使细胞移动性减低，在体外还使细胞转移率下降，表明在HCC中通过Rho/p160ROCK信号途径介导的细胞移动性在肝内转移中起了关键性作用。

　　4 血管形成

　　新生血管形成是恶性肿瘤发展的基本特点。不仅原发瘤的生长依赖肿瘤血管形成，转移灶的建立也依赖肿瘤血管。实体瘤只有具备了血管生成表型后才能恶性生长和发生成功转移。如果没有血管生成，癌结节可长期处于“冬眠状态”。肝癌主要为多血管肿瘤，组织内血管形态极不规则，部分血管无明显管腔，仅为单个或数个内皮细胞团块，呈明显的异质性。这些新生血管缺乏完整性，管壁仅排列一层内皮细胞，无平滑肌等正常血管结构，有裂隙状基底膜，并呈渗漏状态，新生的肿瘤血管在肿瘤和血循环之间建立一个桥梁，易使肝癌细胞从原发部位向远处转移，这有助于解释肝癌易于发生血行转移到肺的现象。

　　肿瘤血管生成需多种细胞因子共同参与，其中血管内皮生长因子(VEGF)被认为是最强的血管形成因子。VEGF与其受体结合后可增加血管通透性，并促进内皮细胞增殖，使血管形成。此类受体皆为酪氨酸激酶受体，包括VEGFR-1(flt-1)、VEGFR-2 (KDR/flk-1)和VEGFR-3(flt-4)。

　　近年研究中，Yasuda等[11]利用免疫组化对28例肝癌组织标本进行研究，在25例中、低分化标本中，20例KDR/flk-1呈连续分布，从而认为在肝癌中VEGFR表达以KDR/flk-1为主。Shimamura等[12]用RT-PCR对143例肝癌伴肝硬化的活检标本中VEGF及VEGFR-2进行检测，肿瘤组织与非肿瘤组织中VEGF浓度无明显差异，而肿瘤组织KDR/flk-1表达率为100%，且在肿瘤组织与非肿瘤组织中有显著差异(P<0.001)。而flt-1表达则无此差异，故认为VEGF诱导的血管生成和肿瘤生长与KDR/flk-1在肝癌组织中的表达关系密切。以上研究表明在肝癌中起主要作用的是VEGFR-2。VEGF与VEGFR-2结合后使受体发生二聚体、酪氨酸残基磷酸化、激活下游与促有丝分裂、迁移、抗凋亡等效应相关的信号分子，从而发挥作用。Yoshiji等[13]用VEGFR-1和VEGFR-2的抗体R1单克隆抗体(R1mAb)及R2单克隆抗体(R2mAb)给小鼠注射，观察其对二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)诱导肝癌发生的抑制作用，发现R1mAb和R2mAb可明显减少肝癌结节数量，且R2mAb效应强于R1mAb(P<0.01)。而R1mAb与R2mAb联合应用可完全抑制肝癌结节发生。肝癌组织VEGF表达促进血管生成为肝癌细胞远处转移提供必要条件。实验表明，用R1mAb和R2mAb阻断小鼠VEGF诱导的血管生成后，小鼠肝癌肺转移发生率明显降低，对照组为80%,R1mAb组为40%,R2mAb组为20% ,R1mAb加R2mAb组为0%。而转移灶数目分别为6.4±1.4、2.7±1.7、1.0±0.5和0个。此外，门静脉癌栓来源于侵入血管内的肝癌细胞，伴门静脉癌栓的肝癌组织VEGF mRNA表达明显高于无癌栓者。且多因素分析表明VEGF表达与门静脉癌栓形成相关。由此可见VEGF在促进肝癌细胞侵袭与转移中起重要作用。Zhao等[14]在临床研究中也证实了这一点，他们发现肝癌病人血清VEGF的水平显著高于良性肝脏疾病病人和正常人群;在肝癌病人中，已有转移者血清VEGF水平较无转移者有显著性增高。此外，术前血清VEGF水平可作为肝癌侵袭转移和预后的重要预测指标[13]676-681。Von Marschall等[15]研究指出，在HCC中缺氧(1%O2)是血管生成的中心刺激物，在癌肿中临近缺氧的肿瘤细胞的VEGF表达水平明显增高。缺氧上调VEGF基因表达的分子机制主要有二:活化VEGF的转录;加强VEGF mRNA的稳定性。

　　5 小结

　　肝癌的侵袭转移是一个多步骤、多因素参与的复杂过程:除上述因素外，还有其他相关因子在侵袭转移中亦发挥了重要作用，例如:癌基因和抑癌基因等。癌基因的激活(包括Bcl-2、H-ras、mdm2等)、抑癌基因的失活(包括p53、nm23-Hl、Kai-i等)均可诱发肝癌细胞转移表型的改变，从而导致转移的发生。研究肝癌侵袭转移的分子机制，有助于筛选肝癌的预后指标，并寻找新的治疗靶点，发现防治肝癌侵袭转移的有效药物，从而改善肝癌的治疗效果。

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