肝硬化组织中MMP-1和VEGF的表达及其意义

　　作者：陈妍, 崔文丽, 黎音 作者单位：新疆医科大学基础医学院病理解剖学教研室, 新疆 乌鲁木齐 830011

　　【摘要】 目的：探讨基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)在肝硬化形成中的作用及其相互关系。方法：用免疫组织化学的方法检测57例肝硬化组织和10例正常肝组织中MMP-1和VEGF的表达。结果： MMP-1和VEGF在肝硬化组织中的表达明显高于正常肝组织中的表达(χ2分别为8.233和 10.876,P均< 0.05)。MMP-1和VEGF在肝硬化组织中的表达一致(χ2=2.227 ,P>0.05)。结论: MMP-1和VEGF能促进肝硬化的发展过程。

　　【关键词】 肝硬化; 基质金属蛋白酶; 血管内皮生长因子; 免疫组织化学

　　Expression of matrix metalloproteinase-1 and vascular endothelial growth factor in liver cirrhosis and its pathological significance

　　CHEN Yan, CUI Wen-li, LI Yin

　　(Department of Pathology, Xinjiang Madical University, Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: To investigate the expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in liver cirrhosis tissues, and to discuss the possible meanings of their roles in liver fibrosis.Methods: Fifty seven liver cirrhosis and 10 normal specimens were detected by immunohistochemistry (Envision).Results: The expressions of MMP-1 and VEGF were increased in liver cirrhosis tissues(χ2=8.233 and 10.876, P<0.05).The expressions of MMP-1 and VEGF in liver cirrhosis tissues were uniform (χ2=2.23, P>0.05).Conclusion: MMP-1 and VEGF may promote the development of liver cirrhosis.

　　Key words: liver cirrhosis; matrix metalloproteinase; vascular endothelial growth factor; immunohistochemistry

　　肝纤维化是肝硬化的病理基础，是继发于各种原因引起的肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿反应,以肝星状细胞(HSC)激活产生大量细胞外基质(ECM)，ECM在肝内过量沉积为其病理特征[1,2]。研究表明,肝脏ECM代谢主要由基质金属蛋白酶(MMPs)所调节,MMPs促进ECM降解,而其抑制因子金属蛋白酶组织抑制物(TIMPs)则通过抑制MMPs阻止ECM降解，肝硬化的发展取决于MMPs与TIMPs的平衡。大量的研究表明，肝硬化的发生、发展是多种因素综合作用的结果，近年来，随着对肝纤维化发病机制的广泛深入研究，明确指出肝纤维化是完全可逆转的观点[3]。因此研究致纤维化的相关因子，为临床治疗提供靶点具有重要的现实意义。本实验应用免疫组织化学方法检测肝硬化组织中基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达及分布情况，探讨MMP-1和VEGF在肝硬化形成中的作用及其表达的相互关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 资料来源 57例肝硬化组织来自新疆医科大学第一附属医院病理科，其中男性35例，女性22例，年龄19～74岁。10例正常肝组织来自新疆医科大学病理教研室非肝病死亡尸体解剖标本，其中男性6例，女性4例，年龄22～38岁。

　　1.2 方法 将标本石蜡包埋,4 μm连续切片，Envision法免疫组织化学染色(按试剂盒说明书操作)。免疫组织化学Envision试剂盒和鼠抗人MMP-1单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司，鼠抗人VEGF单克隆抗体购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

　　1.3 阳性结果判断 MMP-1在纤维间隔周围以及汇管区的部分肝细胞和纤维间隔内的间质细胞胞质中有棕黄色颗粒为阳性。VEGF以肝细胞胞质内有棕黄色颗粒为阳性，阳性细胞≤30%为阴性, 阳性细胞>30%为阳性[4]。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件对数据进行处理，数据的比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 MMP-1和VEGF在正常肝组织和肝硬化组织中的表达 MMP-1和VEGF在正常肝组织中阳性表达率分别为50.0%和20.0%,在肝硬化组织中阳性表达率分别为87.7%和73.7%，肝硬化组织中的阳性表达率明显高于正常肝组织(P<0.05)(表1)。

　　表1 MMP-1和VEGF在正常肝组织和肝硬化组织中的表达(略)

　　2.2 MMP-1和VEGF在肝硬化组织中的表达 MMP-1与VEGF同为阳性者35例，MMP-1阳性VEGF阴性者15例，MMP-1阴性VEGF阳性者7例，MMP-1与VEGF同为阴性者0例，差异无统计学意义(χ2=2.227，P=0.134)，即VEGF和MMP-1在肝硬化组织中的表达阳性概率相等，表达情况一致(表2)。

　　表2 MMP-1和VEGF在肝硬化组织中表达情况的比较(略)

　　3 讨论

　　肝脏对组织损伤能产生相应的修复反应,先是通过炎症细胞浸润清除坏死组织，随后是肌纤维细胞增生、基质合成增加,继之组织重构和再生,慢性肝损伤时不恰当的修复反应常可使组织重构从而导致肝纤维化甚至肝硬化。在组织修复过程中,HSC持续活化，产生各种细胞因子和化学因子、表达细胞因子和化学因子受体，合成大量ECM是这一过程的中心环节[5]。

　　研究证实参与纤维化的胶原主要为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型,肝细胞、HSC、肝窦内皮细胞(SEC)均可产生Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原，在肝纤维化时合成量增加[2]。纤维化时HSC被激活转化为肌纤维细胞，产生大量细胞外基质，其产生胶原的能力为SCE的20倍，主要为Ⅰ型胶原[1]。间质胶原酶MMP-1是成纤维细胞、巨噬细胞、上皮细胞等细胞来源的成纤维细胞型胶原酶，主要降解Ⅰ-Ⅲ型胶原及Ⅶ和Ⅹ型胶原[6～8]。

　　本研究结果显示MMP-1在肝硬化组织中的表达比在正常肝组织中明显增高，与蒋莹等[9]的研究结果一致，大量的动物实验也证明MMP-1在肝纤维化胶原降解过程中起重要的作用[10,11]。

　　TIMPs可通过与MMPs非共价结合而抑制MMPs的活性，也可与MMPs酶原结合阻止其活化，从而抑制ECM的降解。有研究显示金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)蛋白的阳性表达随肝纤维化程度的加重而增加，MMP-1蛋白的阳性表达随肝纤维化程度的加重无明显变化，提示在肝纤维化发生、发展中，MMP-1没有改变，而TIMP-1升高，结果肝脏中TIMP-1/MMP-1的比值增加，使ECM免受MMPs的降解[9]。MMP-1与TIMP-1的平衡在肝纤维化形成过程中起着至关重要的作用,肝纤维化形成的主要原因不是因为MMP-1蛋白的表达减少,而是由于TIMP-1蛋白的进行性升高,使MMP-1活性受到抑制,TIMP-1/MMP-1比值逐渐上升,进一步说明基质合成、降解平衡的逐渐失调加速了肝纤维化的形成[11]。

　　VEGF是一种分子量为40～50kDa的分泌性糖蛋白，有强烈提高血管通透性的作用，能引起血浆蛋白(包括纤维蛋白原)渗出血管，它是内皮细胞的一种特异性丝裂原，具有选择性诱导内皮细胞增殖、血管生成的作用，受缺氧、低血糖及多种生长因子调节，在肿瘤血管生成、肿瘤转移、组织修复等过程中发挥重要作用[12]。研究已证实VEGF在肝窦内皮细胞的生长、肝细胞再生以及原发性、继发性的肝癌发生、发展，部分良性肝病如血管瘤、肝炎等中起重要作用。李伟平等[13]对大鼠酒精性肝纤维化的研究证明一旦纤维化显著，VEGF的表达率就明显上升。Corpechot等[14]通过肝硬化动物模型的实验得出结论,肝损伤后肝细胞缺氧直接导致血管发生和肝纤维化,在此过程中VEGF和其受体flt-1表达上调，相对应的微血管密度显著增加。严家春等[15]发现VEGF在肝组织内表达的强弱与纤维化程度有关,认为肝组织VEGF表达增强可促进肝血管生成及肝窦毛细血管化。本研究结果显示VEGF在肝硬化组织中的表达比在正常肝组织中的表达明显增高，并且VEGF与MMP-1在肝硬化组织中的表达情况一致。

　　肝硬化发生时肝组织处于缺血、缺氧状态，导致胶原在Disse间隙沉积增加，使肝血窦基膜形成，影响血窦与肝细胞之间的营养物质交换，缺血、缺氧加重。缺氧状态激活肝细胞、HSC等产生多种细胞因子，其中转化生长因子(TGFβ)是重要的促纤维化因子。TGFβ一方面可通过启动和维持HSC的活化促进HSC的增殖，促进HSC等细胞合成ECM，抑制MMPs的产生,促进TIMPs的产生,以阻碍胶原的降解发挥其促纤维化的作用。另一方面可上调VEGF的表达，使其诱导内皮细胞分裂、增殖、游移，最终形成新生毛细血管。但VEGF会使血管通透性增加，引起血浆纤维蛋白原外渗、沉积，继而管腔狭窄甚至堵塞，故此新生血管并不能改善局部血供[16]。

　　肝纤维化时MMP表达增加是机体的适应性变化，旨在降解胶原，改善肝组织的微循环，但因同时存在着TIMP的拮抗作用，二者之间的平衡一旦打破，若TIMP抑制作用较MMP降解胶原的作用强，则肝纤维化进一步发展，最终发展为肝硬化，反之肝纤维化进程可以停滞甚至逆转，此种拮抗作用贯穿于肝硬化发展过程始终。VEGF可以诱导生成新生毛细血管，但因新生血管通透性大，血浆纤维蛋白原等外渗可堵塞管腔，使其并不能发挥改善血供的作用。缺氧状态持续存在使得HSC不断活化，肝纤维化进一步进展。MMP与VEGF在肝硬化早期的作用均为改善局部肝组织血供状态，MMP-1和VEGF在肝硬化组织中的一致性高表达,提示MMP-1和VEGF是肝硬化形成过程中一对重要的调节因子，二者协同作用以促进肝硬化的发展。

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