MMP10、MMP11及TIMP2在胃癌组织中的表达

　　作者：张慧,纪祥瑞,赵洁 作者单位：青岛大学医学院病理学教研室，山东 青岛 266021; 青岛大学医学院附属医院病理科

　　【摘要】 目的 检测胃癌组织中基质金属蛋白酶10(MMP10)、基质金属蛋白酶11(MMP11)和基质金属蛋白酶抑制因子2(TIMP2)的表达，探讨胃癌侵袭转移的分子机制。方法 采用免疫组织化学方法检测MMP10、MMP11及TIMP2在54例胃癌和20例癌周正常黏膜组织中的表达。结果 胃癌组织中MMP10、MMP11及TIMP2的表达与癌周正常黏膜组织比较，差异均有显著性(χ2=4.30-6.37，P<0.05)。MMP10和MMP11的表达均与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关(χ2=6.46-15.91，P<0.05、0.01);TIMP2表达与淋巴结转移有关(χ2=4.91，P<0.05)。MMP10、MMP11表达与TIMP2表达呈正相关关系(r=0.29、0.34,P<0.05)。结论 MMP10、MMP11及TIMP2的异常表达与胃癌的侵袭转移密切相关，可作为判断胃癌生物学行为和预后的重要指标。

　　【关键词】 胃肿瘤;基质金属蛋白酶类;基质金属蛋白酶抑制剂

　　EXPRESSIONS OF MATRIX METALLOPROTEINASE10, METALLOPROTEINASE11 AND TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASE2 IN GASTRIC CARCINOMA

　　ZHANG HUI, JI XIANGRUI, ZHAO JIE

　　Department of Pathology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China);

　　[ABSTRACT] Objective To study the expressions of matrix metalloproteinase10 (MMP10), metalloproteinase 11 (MMP11) and tissue inhibitor of metalloproteinase2 (TIMP2) in gastric carcinoma and explore the mechanism of invasion and metastasis of the cancer. Methods Expressions of MMP10, MMP11 and TIMP2 were studied via immunohistochemistry in specimens resected from 45 patients with gastric carcinoma and 20 paraneoplastic normal mucosa (PNM). Results Differences in expressions of MMP10, MMP11 and TIMP2 were significant between cancer mucosa and PNM (χ2=4.30-6.37,P<0.05). Expressions of MMP10 and MMP11 were both correlated with tumor size, depth of tumor invasion, LN metastasis and TNM stage (χ2=6.46-15.91;P<0.05,0.01); expression of TIMP2 was correlated with LN metastasis (χ2=4.91,P<0.05), and that of MMP10 and MMP11 were positively correlated with that of TIMP2 (γ=0.29,0.34;P<0.05). Conclusion The abnormal expressions of MMP10, MMP11 and TIMP2 are closely related with the metastasis and that can be used as important parameters for the judgement of biological behaviour and prognosis of gastric carcinoma.

　　[KEY WORDS] stomach neoplasms; matrix metalloproteinases; tissue inhibitor of metalloproteinase

　　肿瘤的侵袭转移在本质上是一个多步骤的复杂事件，主要包含肿瘤细胞的黏附改变、细胞外基质(ECM)降解增加、肿瘤细胞的迁移、细胞增殖改变及新生血管形成等诸多因素的共同作用[1]。其中，ECM的降解及基膜的破坏是肿瘤浸润和转移的先决条件。ECM 和基膜主要组织结构的破坏和降解需要相应的溶解酶参与。溶解酶系统由一庞大蛋白溶解酶家族组成，被称为基质金属蛋白酶(MMPs)。业已证实MMPs及其相应的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)在肿瘤侵袭和转移过程中发挥着重要作用[23]。本研究采用免疫组化方法检测胃癌及癌周黏膜组织中MMP10、MMP11及TIMP2的表达，旨在探讨三者在胃癌发生、发展中的作用及其与胃癌临床病理特征之间的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本及来源

　　收集我院病理科2008年2月-2009年4月间存档胃癌手术标本54例,癌周正常黏膜20例，所有病人术前均未经过放疗和化疗。54例胃癌病人中男41例，女13例;年龄31～86岁，中位年龄61岁;无淋巴结转移者19例，有淋巴结转移者35例。所有组织标本均经40 g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，制成4 μm厚连续切片4张;行常规苏木精伊红染色1张，MMP10、MMP11及TIMP2免疫组织化学染色各1张。

　　1.2 染色方法

　　鼠抗人TIMP2单克隆抗体工作液，PV9000二步法检测试剂盒及DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司;兔抗人MMP10多克隆抗体原液0.1 mL购于北京博奥森生物技术有限公司;兔抗人MMP11单克隆抗体工作液购于北京康为世纪生物科技有限公司。采用PV9000二步法进行免疫组织化学染色, 用PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。MMP10免疫组织化学实验一抗浓度为1∶100。

　　1.3 结果判定标准

　　MMP10、MMP11及TIMP2均以细胞浆内和(或)细胞膜上出现黄色或棕黄色颗粒为阳性着色。根据DAB显色结果，由两位病理医师在光学显微镜下先后观察，每张切片随机选取10个高倍镜视野，每个高倍镜视野下计数100个肿瘤细胞，取其平均值。按阳性细胞所占的百分率分为：阴性(-)，即阳性细胞数占0～10%;阳性(+)，即阳性细胞数>10%。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS 13.0及PPMS 1.5[4]统计学软件进行统计处理，数据间比较采用卡方检验和Pearson相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 MMP10、MMP11及TIMP2的表达及定位

　　MMP10、MMP11及TIMP2阳性主要以胞浆着色为主，其阳性表达率分别为75.9%(41/54)、59.3%(32/54)、66.7%(36/54)。胃癌组织中三者的表达与癌周正常黏膜组织比较，差异均有显著性(χ2=4.30-6.37，P<0.05)。在癌周正常黏膜组织，MMP10、MMP11及TIMP2黏膜腺体表达呈散在单个或灶状着色;但在癌组织中呈灶状或弥漫性着色，在癌巢边缘及癌巢侵袭前沿，癌细胞MMP10、MMP11及TIMP2的表达明显较其他部位为强，而且血管内皮细胞及少数炎细胞也有表达。

　　2.2 MMP10、MMP11及TIMP2表达与胃癌临床病理特征的关系

　　MMP10和MMP11的表达均与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关(χ2=6.46-15.91，P<0.05、0.01);TIMP2表达与淋巴结转移有关(χ2=4.91，P<0.05)。见表1。MMP10、MMP11表达与TIMP2表达呈正相关关系(r=0.29、0.34,P<0.05)。见表2、3。表1 MMP10、MMP11和TIMP2表达与胃癌临床病理特征关系(略)注：*与浆膜相比较，P<0.05。表2 MMP10和TIMP2的相关性(略)　 表3 MMP11和TIMP2的相关性(略)

　　3 讨 论

　　MMPs是降解ECM成分的一大类含2价锌离子水解酶, TIMPs则是MMPs 的天然抑制物,两者在ECM代谢中的相互作用是肿瘤细胞侵袭及转移的关键因素。ECM主要由胶原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基葡聚糖组成。ECM位于上皮或内皮细胞的基底部，即以基膜的形式存在，位于细胞间黏附结构时以间质结缔组织形式存在。Ⅳ型胶原是血管基膜的主要成分。MMPs家族中的明胶酶类(MMP2和MMP9)因其降解Ⅳ型胶原的能力而成为胃癌转移的研究重点，而以降解间质为主的基质溶解素类则研究较少。MMP10及MMP11同属于基质溶解素类，它们降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白、纤维连接蛋白和层黏连蛋白等。TIMP2可与活化的MMPs以1∶1共价键结合，从而二者活性水平之间保持着动态平衡状态，这种平衡保证了在正常生理情况下的细胞的迁移和ECM的重新塑造。

　　近年来研究发现, 肿瘤组织中MMP10的表达明显高于相应的正常组织及良性腺瘤[5]。在人的结直肠癌、肺癌中MMP10表达明显增加, 与肿瘤病理学特征密切相关[67]。ZHAO 等[8]报道，胃癌组织中MMP10的表达与肿瘤的分化程度、TNM分期、淋巴结的转移、浸润深度相关。既往国内外研究发现，MMP11在大多数肿瘤如乳癌、胰腺癌、食管癌中表达[911]，并认为与肿瘤的发生发展和预后不良相关。本研究结果显示，MMP10、MMP11的蛋白表达与胃癌的恶性程度有关。MMP10、MMP11表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移、肿瘤TNM分期有关(P<0.05、0.01)，表明二者参与了肿瘤侵袭过程，与肿瘤的远处转移有关。可见MMP10、MMP11的表达贯穿胃癌发病的整个过程,其高表达提示胃癌病人预后不佳。本文结果显示，胃癌与癌周正常黏膜组织间MMP10、MMP11表达有显著差异(P<0.05)，进一步证实了二者在肿瘤演进过程中起着正向作用。本研究还显示，同一瘤体中不同的瘤细胞分泌MMP10、MMP11的水平不同，处于癌巢周缘或侵袭前沿的瘤细胞其MMP10、MMP11分泌水平明显强于周围瘤细胞。而且，不仅瘤细胞本身分泌MMP10、MMP11，瘤细胞周围的炎细胞及血管内皮细胞也分泌MMP10、MMP11，而在本实验的癌周正常黏膜组织中，并未观察到炎细胞的阳性表达，提示瘤细胞具有诱导周围炎细胞分泌MMP10、MMP11的能力，这种分泌被认为是肿瘤诱导的宿主反应[12],这种反应与瘤细胞促进的炎症反应互相促进从而形成恶性循环。

　　组织有不正常的MMPs水平的分泌，并不一定预示着肿瘤一定发生局部侵袭和远处转移，因为有MMPs抑制因子的抑制侵袭转移作用，MMPs抑制因子中尤以天然抑制因子TIMPs对其的抑制作用较为重要。本研究结果显示，TIMP2表达与淋巴结转移有关(P<0.05)，其在胃癌与癌周正常黏膜组织间表达差异也有显著意义(P<0.05),而且与MMP10、MMP11表达有正相关关系(P<0.05)。国内外相关文献报道中，有与此相似和相反的研究结果[1314]。按一般思维，当胃癌组织中MMPs高表达时，TIMP2应该低表达或丧失表达。但是，本文结果证实TIMP2在胃癌组织的表达与MMP10、MMP11的表达显著相关，随着MMP10、MMP11表达增高而调高表达。分析TIMP2表达增高的原因，推测有两种可能。①MMP10、MMP11表达增高时TIMP2也增高，这可能与机体基因水平的平衡调节有关。胃癌组织中TIMP2蛋白表达高于癌周组织，这种TIMP2过表达可能是其对MMP10、MMP11高表达的一种反应性增高，即肿瘤细胞在分泌MMPs增多的同时，也同步补偿性分泌较多的TIMPs，当然此补偿性分泌并不充分。②肿瘤细胞的TIMP2为突变的基因产物，即TIMP2的基因发生突变，使其编码蛋白质部分或全部丧失抑制MMPs的功能。本研究结果提示，虽然胃癌组织的MMP10、MMP11及TIMP2表达均增高，而且与其恶性程度呈正相关，但是，MMP10、MMP11与TIMP2之间的平衡状态失调。因此，三者的失衡在肿瘤演进过程中发挥着更重要的作用。

　　本实验从肿瘤演进角度证实MMP10、MMP11及TIMP2在胃癌组织中过表达，而MMP10、MMP11与 TIMP2之间平衡失调也是肿瘤恶性进展、侵袭转移的重要因素。因此，可以此为基础在基因水平上对TIMP2进一步研究，以明确其基因突变情况，为胃癌的诊断和治疗提供新思路。

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