IL1β511位点和TNFα308位点基因多态性与陕西汉族非贲门胃癌的关系

　　作者：贾皑，龚均，厉英超，苌新明，郝志明，董 蕾 作者单位：西安交通大学医学院：1. 第二附属医院消化内科，陕西西安 710004;2. 第一附属医院消化内科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 探讨促炎症因子白细胞介素(IL)1β基因启动子区511位点及肿瘤坏死因子α(TNFα)308位点基因多态性与陕西汉族非贲门胃癌易感性的关系。方法 用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性(PCRRFLP)的方法对陕西汉族106例非贲门胃癌及108例非溃疡性消化不良患者(对照组)进行IL1β启动子的511位点和TNFα的308 位点多态性分析。结果 IL1β基因启动子511位点基因型CC、CT、TT频率在胃癌组和对照组分别为12.3%、54.7%、33%和16.7%、50.9%、32.4%，无显著性差异(P>0.05)。等位基因C、T频率在胃癌组和对照组分别为39.6%、60.4%和42.1%、57.9%，其基因型频率和等位基因频率在胃癌组和对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。TNFα的308位点的基因型GG、GA、AA频率在胃癌组和对照组分别为90.6%、1.9%、7.5%和84.3%、12.9%、2.8%，等位基因G、A频率在胃癌组和对照组分别为91.5%、8.5%和85.6%、14.4%，其基因型频率和等位基因频率在胃癌组和对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。结论 IL1β启动子511位点基因多态性及TNFα308基因多态性与陕西汉族非贲门胃癌之间未发现相关关系。

　　【关键词】 白细胞介素1;肿瘤坏死因子α;基因多态性;胃癌;汉族

　　necrosis factor alpha gene with susceptibility of noncardiac gastric

　　cancer in a Han nationality of Shaanxi Chinese populationJIA Ai1,2, GONG Jun1, LI Yingchao2, CHANG Xinming2, HAO Zhiming2, DONG Lei1

　　(1. Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Department of Gastroenterology,

　　the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To investigate the correlation of the polymorphisms of the IL1β promoter region 511C/T and tumor necrosis factorα (TNFα) 308G/A gene with the susceptibility of noncardiac gastric cancer of Shaanxi Chinese population. Methods The polymorphisms in the IL1β promoter region and TNFα were determined by PCRRFLP in a Han nationality of Shaanxi Chinese population. Totally 106 cases of noncardiac gastric cancer and 108 cases of nonulcer dyspepsia as controls were subjected to IL1β and TNFα gene analysis. Results IL1β genotype frequencies of CC, CT and TT were 12.3%, 54.7% and 33% in gastric cancer group; 16.7%, 50.9%, 32.4% in control group respectively. Allele frequencies of C and T were 39.6%, 60.4% in gastric cancer group; 42.1% and 57.9% in control group respectively. TNFα308 genotype frequencies of GG, GA and AA were 90.6%, 1.9% and 7.5% in gastric cancer group; 84.3%, 12.9%, 2.8% in control group respectively. Allele frequencies of G and A were 91.5% and 8.5% in gastric cancer group; 85.6% and 14.4% in control group respectively. There were no significant differences in the allele frequency and genotype of IL1β511C/T and TNFα308 (P>0.05). Conclusion Neither the 511C/T polymorphism in the IL1βpromoter region nor TNFα308 gene polymorphism was associated with susceptibility of noncardiac gastric cancer in a Han nationality of Shaanxi Chinese population.

　　KEY WOEDS: interleukin1β; tumor necrosis factorα; gene polymorphism; gastric cancer; Chinese population

　　胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，陕西是胃癌的高发区，胃癌年患病率和死亡率均处于全国前列[1]。幽门螺杆菌(H.pylori)感染与胃癌发生密切相关，1994年WHO将其定为Ⅰ类致癌原。人群中几乎有一半人终生感染幽门螺杆菌，但是只有极少数人发展成胃癌。导致产生这种不同结果的原因目前尚不清楚，研究认为可能是细菌菌株、宿主易感性及环境因素相互作用的结果[2] 。近年来，探讨基因多态性与胃癌遗传易感性的关系，特别是一些功能基因与胃癌关系日益受到人们的重视。胃炎是胃癌多阶段形成过程中的先决条件，细胞因子参与启动、调节炎症反应，其功能基因多态性会影响细胞因子的产生和分泌。一些研究表明编码炎症因子白细胞介素1β(interleukin1β, IL1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNFα)的基因多态性可能影响H.pylori感染后炎症转归结果。IL1β基因促进子区包含两个等位基因多态性，即511CT转换和31TC转换。ElOMAR等[3]在高加索人群中发现携带IL1β511T和31C等位基因可增加个体罹患胃癌的危险性，随后该结果先后被葡萄牙人群[4]和美国人群[5]研究所证实。但CAMARGO等[6]对IL1β基因多态性与胃癌易感性在亚洲人群中进行了Meta分析，结果表明 IL1β C511T多态性并不增加胃癌的患病风险。因此，IL1β511基因多态性与胃癌是否相关，尚需进一步在不同国家和地区对不同种群进行研究。

　　TNFα基因启动子区308位点存在影响转录水平的单核苷酸多态GA转化，308A等位基因与TNFα高表达有关。MACHADO等[7]发现，TNFα308A基因型增加其携带者胃癌发生的危险性。但WU等[8]发现台湾地区胃癌与对照组之间没有TNFα基因型的差异。韩国的一项病例对照研究表明，308A等位基因与胃癌的发病风险无关[9]，意大利一项对TNFα308与胃癌高发区和低发区关系研究表明其与胃癌易感性无关[10]。不同种族、不同地区乃至不同个体之间遗传特征均可能有不同程度的变异，因此有必要在不同国家和地区对不同种群进行研究。本研究采用聚合酶链限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术对IL1β511和TNFα308基因多态性进行检测和分析，探讨其与陕西汉族非贲门胃癌易感性的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 选择从2005～2006年分别在我院经病理诊断为胃癌(包括胃体癌及胃窦癌)患者106例，对照组为非溃疡性消化不良患者108例，患者均无其他系统肿瘤或慢性疾病。标本分别取自胃镜下活检和手术切除标本，胃镜下分别于窦部小弯侧和大弯侧各取一块组织，在胃体中部大、小弯侧各取一块组织，其中窦部一块组织用于H.pylori检测，两块组织置于eppendorf管，置-20℃冰箱保存，用于实验提取DNA，另一块用于组织学检查。得到研究对象的知情同意后，签署知情同意书。病例与对照通过流行病学面访调查，获得个人健康状况、吸烟、饮酒等资料，其中吸烟者定义为每天吸烟并超过1年;饮酒者定义为每周饮白酒3次或以上并超过半年。

　　1.2 仪器与试剂 DNA热循环仪(德国Eppendorf公司)，电泳仪、凝胶成像仪(美国BioRad公司)，3730测序仪(美国ABI公司)。NcoⅠ和AvaⅠ限制性内切酶(MBI fermentas)，chelex100(BioRad)、蛋白酶、PCR扩增试剂盒、DNA标记marker(北京天为时代有限公司)。PCR引物由北京奥科生物技术有限公司合成。快速尿素酶试剂(RUT)(福建三强生物化工有限公司)。H.pylori抗体ELISA试剂盒(上海天呈科技有限公司)。

　　1.3 DNA提取 采用chelex100从冰冻组织和外周血白细胞提取DNA。取血2～5mL或组织加700μL去离子水，震荡离心，重复洗2次，再加chelex100 200μL，蛋白酶6mL，56℃过夜，放100℃ 8min，12000r/min离心5min，提取上清即DNA。

　　1.4 基因分型

　　1.4.1 IL1基因分型 扩增IL1基因的PCR引物为：F 5′GTTTAGGAATCTTCCCACTT3′，R 5′TGGCATTGATCTGGTTCATC3′，PCR扩增体系总体积为50μL，内含引物对2×2μL，模板DNA 3μL，mix 10μL，超纯水4μL。PCR扩增条件：94℃变性5min，然后94℃ 40s，52℃ 40s，72℃ 1min的顺序进行35个循环，最后72℃延伸6min。产物于4℃保存。

　　PCR产物的鉴定：取5μL的PCR产物与2μL的含有溴酚蓝的加样缓冲液混匀后，经20g/L琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外灯下观察电泳结果，304bp片段即为PCR产物。

　　PCR扩增产物限制性内切酶消化：在20μL体系中进行，其中包括AvaⅠ限制酶1μL(10u/μL)，10×buffer 2μL，PCR反应产物10μL，超纯水7μL。混匀后置于37℃恒温水浴箱中消化3h，加入5μL含有溴酚蓝的加样缓冲液终止反应。限制性内切酶消化产物鉴定：取5μL消化产物用30g/L琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察。

　　1.4.2 TNFα基因分型 扩增TNFα基因的PCR引物为：F5′GCAATAGGTGAGGGCCAT3′，R5′TGGGGACACACAAGCATCAA3′，PCR扩增体系总体积为50μL，内含引物对2×2μL，模板 DNA 3μL，mix 10μL，超纯水4μL。PCR扩增条件：95℃变性5min，然后94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s的顺序进行35个循环，最后72℃延伸10min。取PCR扩增产物10μL，加入NcoⅠ限制性内切酶4u，37℃恒温水浴箱中消化3h，终止反应。

　　PCR产物的鉴定：取5μL的PCR产物与2μL的含有溴酚蓝的加样缓冲液混匀后，经20g/L琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外灯下观察电泳结果，150bp片段即为PCR产物。

　　PCR扩增产物限制性内切酶消化：在20μL体系中进行，其中包括NcoⅠ限制酶4u，10×buffer 2μL，PCR反应产物10μL，超纯水7μL。混匀后置于37℃恒温水浴箱中消化3h，加入5μL含有溴酚蓝的加样缓冲液终止反应。限制性内切酶消化产物鉴定：取5μL消化产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察。

　　1.5 幽门螺杆菌检测 采用快速尿素酶、14C呼气试验和血清IgG抗体检测H.pylori感染，任何一项阳性者即认为阳性。

　　1.6 统计学分析 采用SPSS软件15.0进行数据整理和分析，统计方法包括：病例组与对照组间基本特征均衡性应用χ2检验;IL1β和TNFα基因型在病例组与对照组中分布差异用χ2检验，采用OR值和95%可信区间评估基因型和胃癌的危险度，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 研究对象一般特征 胃癌病例组与对照组之间在年龄、性别等人口学特征上无统计学差异，说明两组均衡可比。其他特征如吸烟和饮酒因素在病例组与对照组中无显著性差异，H.pylori感染在两组中分布亦无显著性差异(表1)。

　　2.2 AvaⅠ识别的IL1β511基因型与非贲门胃癌关系分析 IL1β511 PCR扩增产物为304bp经AvaⅠ限制性内切酶消化，分成三种不同的基因型，TT基因型为304bp，TC基因型为190、104和304bp，CC基因型为190、104bp(图1)。IL1β511位点基因型与等位基因频率比较(表2)。IL1β基因启动子511位点基因型CC、CT、TT频率在胃癌组和对照组分别为12.3%、54.7%、33%和16.7%、50.9%、32.4%。等位基因C、T频率在胃癌组和对照组分别为39.6%、60.4%和42.1%、57.9%，其基因型频率和等位基因频率在胃癌组和对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。结果表明IL1β511位点基因多态性与非贲门胃癌亦无相关性。表1 胃癌组和对照组一般特征的比较表2 IL1β511基因分型在胃癌组和对照组的分布

　　2.3 NcoⅠ识别的TNFα308基因型与非贲门胃癌关系分析 TNFα308的PCR扩增产物为150bp片段，经NcoⅠ限制性内切酶消化，产生130bp和20bp两个片段，也分成三种不同的基因型，即GG基因型150bp，AG基因型为150、130和20bp三种产物，AA基因型为130、20bp。TNFα的308位点的基因型GG、GA、AA频率在胃癌组和对照组分别为90.6%、1.9%、7.5%和84.3%、12.9%、2.8%，等位基因G、A频率在胃癌组和对照组分别为91.5%、8.5%和85.6%、14.4%，胃癌组和对照组之间的基因型和等位基因频率无显著性差异(P分别为0.62和0.18)，结果表明TNFα308位点基因多态性与非贲门胃癌无相关性(表3)。表3 TNFα308多态性基因分型在胃癌组和对照组的分布

　　3 讨 论

　　胃癌发生是多因素、多步骤的病理过程。IL1β基因定位于人染色体长臂2q1321上,其编码的IL1β是非常重要的促炎症细胞因子，在炎症免疫损伤机制中起着主要的调节作用，同时具有强大的抑制胃酸分泌作用。IL1β还是目前发现的最有力的抑酸剂，1mol的IL1β是1mol质子泵抑制剂抑酸作用的100倍。由于其抑酸作用强烈故可导致胃萎缩，从而增加胃癌发生的危险性，在H.pylori感染的胃黏膜损伤和萎缩性胃炎发展及胃癌发生中起重要作用。ELOMAR等[3]在波兰人群的研究中发现，IL1β31C/511T等位基因和IL1RN 2/2纯合子基因型使胃癌发生风险增加，其OR值分别为1.6(95% CI=1.2-2.2)和2.9(95% CI=1.9-4.4)。该发现随后被MACHADO等[5]在葡萄牙人群中的研究也得到证实。与西方国家的研究不同，亚洲国家关于IL1β基因多态性和胃癌关系的研究尚存在争议。KATO等[11]在日本人群中的研究未能证实IL1β511基因多态性与胃癌有关，LEE等[12]在韩国人群中的研究也不支持IL1β511 和IL1RN基因多态与胃癌发病风险有关。我国学者在不同地区包括胃癌高发、低发地区进行了研究，最早由ZENG等[13]比较了陕西高发地区和广东地区普通人群和胃癌的关系，研究发现高发区IL1β511TT与胃癌的发生不相关，但在低发区广东IL1β511T与胃癌发生相关。但类似的研究在其他胃癌高发区IL1β511TT与胃癌关系亦不一致，Yang等[14]在中国江苏人群中发现，IL1β31TT和IL1β511CC基因型均可以显著增加H.pylori感染者患胃癌的风险。ZHANG等[15]在中国西北部人群的研究中发现，IL1β+3954C/T多态可以显著增加个体患胃癌的风险，而IL1β31C/T和IL1β511C/T的多态改变则与胃癌的发生无显著性关联。本研究通过匹配的病例对照研究，研究了陕西人群非贲门胃癌与IL1β511关系，发现其基因分型与非贲门胃癌无关。

　　肿瘤坏死因子α(TNFα)是一种致炎因子，主要是由各种刺激作用于单核巨噬细胞和T淋巴细胞等诱导TNFα基因表达的产物，其量的多少与HLA的基因型有关。人类TNFα基因位于染色体6p21.3区，TNFα基因多态性位点在启动子区域转录起始位点上游第308位点(308位点)，由嘌呤核苷酸A替代了鸟嘌呤核苷酸G，这一位点突变造成了限制性内切酶NcoⅠ的识别位点的缺失，使被A替代的核苷酸序列不能被NcoⅠ识别并切断，即限制性片断长度多态性(RFLP)。MACHADO等[5]发现，TNFα308A基因型增加其携带者胃癌发生的危险性，而且H.pylori和TNFα308基因型联合作用并未严重影响胃癌的危险性，但WU等[8]发现台湾地区胃癌与对照组之间没有TNFα基因型的差异。本实验发现胃癌组基因型分布与对照组无显著性差异，等位基因A或G在病例组(G=91.5%，A=8.5%)和对照组(G=85.6%，A=14.4%，P=0.06)亦无明显差异。但在胃癌组中更多人携带G等位基因，此与ELOMAR等[4]报道的A等位基因促进非贲门胃癌发展有关结论不一致。ElOmar研究认为促炎症因子宿主基因型TNFα308AA更易使胃感染H.pylori后变成低酸和胃萎缩状态，从而导致胃癌发生。本研究未能发现IL1β511和TNFα308与胃癌这种相关性，可能有如下几个原因：首先，可能与种族之间不同的遗传背景有关，本研究人群基因频率和基因分型与西方高加索人群基因频率分布不同;其次胃癌是环境、遗传多因素作用的结果，仅从宿主方面考虑尚不全面，还需结合饮食生活习惯等综合研究，陕西是胃癌高发地区，一些传统饮食生活习惯可能也是胃癌好发的重要原因。

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