IL23受体在炎症性肠病患者外周血淋巴细胞中的表达及意义

　　作者：冯百岁，罗 杰，刘占举 作者单位：郑州大学：1. 第一附属医院消化内科，河南郑州 450052;2. 第二附属医院消化内科，河南郑州 450014

　　【摘要】 目的 检测炎症性肠病(IBD)即溃疡性结肠炎(UC)及克罗恩病(CD)患者外周血淋巴细胞表面白介素23(IL23)受体的表达情况，并讨论其在疾病发生中的意义。方法 收集30例UC患者、16例CD患者和30例正常对照者的外周血，分离外周血单个核细胞(PBMC)，采用三色流式细胞术检测IBD患者外周血CD4+T、CD8+T和CD56+NK细胞表面IL23受体(IL23R)的表达，并与正常外周血比较。结果 UC及CD患者外周血中CD4+T、CD8+T、CD56+NK细胞表面IL23R的表达明显高于对照组(P<0.05)。结论 IBD患者外周血淋巴细胞表面IL23R的表达增高，提示IL23R在IBD的发病过程中起重要作用。

　　【关键词】 IL23受体;炎症性肠病;T淋巴细胞;NK细胞;溃疡性结肠炎;克罗恩病

　　in patients with inflammatory bowel disease and its significanceFENG Baisui1, LUO Jie1, LIU Zhanju2

　　(1. Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital, Zhengzhou University,

　　Zhengzhou 450052; 2. Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital,

　　Zhengzhou University, Zhongzhou 450014, China)ABSTRACT: Objective To detect the expression of IL23 receptor in T lymphocytes and NK cells in peripheral blood mononuclears (PBMC) from patients with inflammatory bowel disease (IBD) as well as its significance in the pathogenesis. Methods PBMC, isolated from 30 patients with UC, 16 patients with CD and 30 healthy controls, were used to determine the expression of IL23 receptor in T lymphocytes and NK cells by flow cytometry. The surface of lymphocytes was determined by threecolour flow cytometry in inflammatory bowel disease patients, and the results were compared with those of normal peripheral blood. Results The expression of IL23R on peripheral CD4+ T, CD8+ T and CD56+ NK cells of patients was obviously higher than that in the control group. Conclusion The expression of IL23R on T lymphocytes and NK cells of patients with IBD was increased, suggesting that IL23 receptor plays an important role in the pathogenesis of IBD.

　　KEY WORDS: interleukin23 receptor; inflammatory bowel disease; T lymphocyte; NK cell; ulcerative colitis; Crohns disease

　　炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)及克罗恩病(Crohns disease, CD)，其病因和发病机制尚未完全明确。免疫异常被公认在IBD的发病中具有极为重要的作用，包括炎症递质、细胞因子及免疫调节等多个方面。其中细胞因子参与免疫反应和炎症过程，是当前关于发病机制的研究热点之一。白介素23(IL23)是2000年发现的一种异源二聚体细胞分子，由特异性的亚单位IL23p19和IL12的一个亚单位p40通过二硫键组成[1]。IL23通过结合细胞膜表面IL23受体复合物，刺激细胞内信号传导系统来诱导细胞激活[2]。研究表明，在某些自身免疫性疾病中，IL23的表达增高[3]。然而，目前尚未见IBD患者外周血T细胞及NK细胞表达IL23R的报道。在本研究中我们采用三色流式细胞术检测IBD患者外周血T细胞及NK细胞表达IL23R的情况,并讨论其在疾病发生中的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例选择 收集2006年7月至2007年10月间郑州大学第二附属医院门诊和住院患者资料。包括活动性UC患者30例，男16例，女14例，年龄18～50岁，其中柳氮黄吡啶治疗12例，美沙拉秦治疗8例，未接受任何治疗10例;活动性CD患者16例，男9例，女7例，年龄18～48岁，其中柳氮黄吡啶治疗7例，美沙拉秦治疗4例，未接受任何治疗5例。以上两组患者经临床、实验室、影像学、内镜或手术以及组织学检查综合性诊断，诊断标准参照中华医学会消化病学分会2001年《对炎症性肠病诊断治疗规范的建议》。另外30例结肠镜检查正常者作为对照组，其中男18例，女12例，年龄18～45岁。上述三组对象均未接受其他任何免疫抑制剂治疗，未合并其他自身免疫性疾病、病毒性肝炎和HIV感染;各组间年龄及性别差异无统计学意义。

　　1.2 主要试剂 生物素标记的羊抗人IL23R抗体(美国R&D公司);FITC荧光标记的抗生物素抗体(中国生物研究院王盛典教授赠予);PerCP荧光标记的鼠抗人CD4单克隆抗体、PE荧光标记的鼠抗人CD8单克隆抗体、PE荧光标记的鼠抗人CD56单克隆抗体均来自美国BD公司;人淋巴细胞分离液购于上海华精生物试剂公司。

　　1.3 外周血淋巴细胞的提取 采集静脉血5mL放入抗凝管中，取离心管一支，加入等体积的淋巴细胞分离液，用移液管把混匀的静脉血小心地加入到淋巴细胞分离液上。将样本放入低温离心机中，于2500r/min转离心30min，提取中间层的淋巴细胞，加生理盐水洗涤2次，得到淋巴细胞。

　　1.4 外周血淋巴细胞IL23R表达的检测 提取好的淋巴细胞100μL加入生物素标记的羊抗人IL23R抗体20μL，避光孵育30min后清洗2次;加入FITC荧光标记的抗生物素的二抗3μL，避光孵育30min后清洗2次;分别加入PE荧光标记的鼠抗人CD4单克隆抗体、PerCP荧光标记的鼠抗人CD8单克隆抗体及PE荧光标记的鼠抗人CD56单克隆抗体各2.5μL，同时设立同型阴性对照;常温下避光孵育20min;加入0.5mL磷酸盐缓冲液(PBS)，FACSCan流式细胞仪检测，BD FACS专用Cellquest 3.0软件分析。

　　1.5 统计学处理 全部数据用流式细胞仪(FACSCan，美国BD公司)和Cellquest 3.0软件进行三色荧光参数的获取和分析。计量资料以±s表示，组间数据比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 外周血CD4+ T细胞表面IL23R的表达情况 健康对照组、CD患者组及UC患者组的IL23R+CD4+ T细胞的频率分别为(0.34±0.20)%(图A)、(4.62±1.10)%、(4.14±0.83)%，与健康对照组相比，CD和UC患者CD4+T细胞表面IL23R的表达均明显增高(P<0.05)。

　　2.2 外周血CD8+ T细胞表面IL23R的表达情况 健康对照组、CD患者组及UC患者组的IL23R+CD8+ T细胞的频率分别为(1.12±0.22)%、(6.42±1.74)%(图B)、(4.79±2.06)%，与健康对照组相比，CD和UC患者CD8+ T细胞表面IL23R的表达均明显增高(P<0.05)。

　　2.3 外周血CD56+ NK细胞表面IL23R的表达情况 健康对照组、CD患者组及UC患者组的IL23R+CD8+ NK细胞的频率分别为(1.34±0.46)%、(5.73±1.50)%、(5.16±1.47)%(图C)，与健康对照组相比，CD和 UC患者CD56+ NK细胞表面IL23R的表达均明显增高(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　IL23是属于IL12家族的成员，主要由激活的单核巨噬细胞及树突状细胞产生，而后者是肠黏膜固有层的主要组成部分。近来发现IL23也可由大脑中的小胶质细胞分泌产生[4]。现已证实IL23在自身免疫性疾病中发挥了重要的作用，如在实验性过敏性脑脊髓炎、类风湿关节炎的模型胶原诱导性关节炎及人类银屑病中起到关键的促炎症作用[5]。

　　本研究发现，在UC和CD患者中，IL23R在外周血CD4+ T细胞和NK细胞表面的表达无显著差异，均高于健康对照组。本实验首次证实IL23R在IBD患者外周血T细胞及NK细胞中的表达显著升高。在CD患者中，IL23R在外周血CD8+ T细胞表面的表达频率为(6.42±1.74)%，稍高于在UC患者中的(4.79±2.06)%，这可能与以往报道的在UC患者的活动期CD8+ T细胞下降而在CD患者CD8+ T细胞升高有关。研究中还发现，肠黏膜病变严重、出血及发热明显的患者IL23R的表达频率更高，健康对照组中IL23R只有微弱的表达，表明IL23R的确参与了IBD的发病过程。健康组织中少量的阳性细胞，可能是生理条件下分泌的IL23细胞因子。既往报道，利用实时定量PCR等方法，IL23p19mRNA在CD中明显增高，在UC中增高不明显，在特异性肠炎中与正常组没有差异[6]，说明IL23在IBD的发病中起到了重要的作用。近来研究发现，其他的细胞因子如IL12及IL18均可诱导IBD患者，尤其是CD患者T细胞的激活,诱导病变肠黏膜组织肉芽肿样炎症形成,导致肠壁增厚,造成黏膜组织损伤[78]。

　　IL23通过结合细胞膜表面IL23R复合物，刺激细胞内信号传导系统，如Jak2、Tyk2、STAT1、STAT3、STAT4和STAT5，尤其是刺激STAT3来诱导细胞激活[2]。IL23R主要表达在激活的免疫记忆型CD4+ T细胞、NK细胞和少部分单核巨噬细胞/树突状细胞[2]。既往报道使用IL23p19操纵子建立的转基因小鼠，回肠末端黏膜固有层内树突状细胞表达大量IL23p19/p40蛋白质，且IL23可刺激炎症肠壁内的免疫记忆型CD4+ T细胞激活[9]。提示在IBD的发病过程中，很可能是IL23作用于T细胞、NK细胞，产生自身免疫作用;激活记忆型CD4+ Th1细胞，分泌多种细胞因子如IFNγ;激活其他免疫细胞和巨噬细胞而分泌一些炎症介质和组织降解因子。NK细胞直接导致组织的损伤。IL23还可以作用于单核巨噬细胞和树突状细胞，以加强其自身的分泌，增强抗原的表达等。通过IL23/IL17轴起作用，IL17可刺激成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和上皮细胞分泌多种促炎性介质IL1、IL6、TNF、NOS2和金属蛋白酶等。体内实验证实IL17的局部产物可产生一个氨基酸附着部位，从而导致炎症细胞的流入和激活，IL17经腹膜注入可引起腹膜炎，经气管注入可引起肺炎[10]。综上所述，IL23在IBD中自身免疫炎症反应的产生、维持、黏膜增生和坏死等方面可能发挥了重要的作用。

　　IL23是一个发现和研究时间不长的细胞因子。它在IBD患者炎症肠壁内蛋白质水平表达，如何刺激炎症肠壁内免疫记忆型CD4+ T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和NKT细胞激活、增殖和分化，以及如何在体内发挥着促炎症效应应答仍然不清，需要进一步深入研究。相信随着先进的分子生物学以及其他技术的应用，对IL23的作用将会有更多更深入的认识，为一些相关疾病的发生机制和治疗手段的研究提供理论基础。

　　【参考文献】

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