胃癌hPOT1基因单核苷酸多态性与幽门螺杆菌感染的关系

　　作者：万顺梅，房殿春，孙少华，葛勤利 作者单位：第三军医大学西南医院全军消化病研究所，重庆 400038;兰州大学第一附属医院病理科，甘肃兰州 730000;兰州解放军第一医院，甘肃兰州 730030

　　【摘要】 目的 探讨胃癌中人端粒保护蛋白1基因(hPOT1)IVS13-98G/T位点单核苷酸多态性与幽门螺杆菌(H.pylori)感染的关系。方法 采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)对150例外科手术切除的胃癌患者和156例正常对照者行基因型分析，采用PCR和Warthin-Starry银染色法检测幽门螺杆菌。结果 胃癌组hPOT1 IVS13-98 T/G位点GG、GT、TT基因型的频率分别22.00%、41.67%、36.67%，G、T等位基因频率分别为42.67%、57.33%;对照组GG、GT、TT基因型的频率分别为24.36%、51.92%、23.72%，G、T等位基因频率分别为49.68%和50.32%。两组G、T等位基因型频率比较无统计学意义(χ2=3.0257, P=0.0820)。以T/T基因型作为参照基因型，G/T和G/G两种基因型OR值分别为0.432(95%CI：0.242-0.772, P=0.005)、0.540(95% CI：0.274-1.064，P=0.075)。胃癌中3种基因型H.pylori的检出率无统计学意义(P>0.05)。结论 hPOT1 IVS13-98G/T单核苷酸多态性可能与甘肃胃癌高发区的胃癌患者有关，可能为胃癌的保护因素。胃癌hPOT1 IVS13-98G/T单核苷酸多态性与H.pylori感染无关。

　　【关键词】 胃肿瘤：人端粒保护蛋白1(hPOT1)基因;多态性;单核苷酸;幽门螺杆菌

　　Relationship between single nucleotide polymorphisms of hPOT1genes and helicobacter pylori infection in gastric carcinoma

　　Wan Shunmei, Fang Dianchun, Sun Shaohua, Ge Qinli

　　1. Gastroenterology Research Center, Southwest Hospital , Third Military Medical University,

　　Chongqing 400038;

　　2. Department of Pathology, the First Hospital of Lanzhou University,Lanzhou 730000;

　　3. The First Hospital of PLA, Lanzhou 730030, China

　　ABSTRACT: Objective To explore the relationship between the single nucleotide polymorphisms (SNPs) of IVS13-98G/T of human protection of telomeres 1 (hPOT1) genes and H.pylori infection. Methods A total of 150 cases of gastric carcinoma and 156 cancer-free controls were genotyped by polymerase chain reaction (PCR) and PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method. H.pylori was identified with PCR and Warthin-Starry methods. Results The frequencies of GG, GT, and TT genotypes of hPOT1IVS13-98 G/T were 22.00%, 41.67% and 36.67% in patients and 24.36%, 51.92%, and 23.72% in controls, respectively. The OR for any GT and GG genotype was 0.432(95% CI: 0.242-0.772, P=0.005) and 0.540 (95% CI: 0.274-1.064, P=0.075) when compared with TT genotype, respectively. There were no differences in genotype distribution and allele frequency of IVS13-98 G/T polymorphism (χ2=3.0257, P= 0.0820). hPOT1IVS13-98 G/T polymorphism was not correlated with H.pylori infection in gastric cancer. Conclusion Our results indicated that IVS13-98 G/T SNP of hPOT1 gene might be associated with reduced risk for gastric carcinoma, but not with H.pylori infection.

　　KEY WORDS: gastric carcinoma;human protection of telomeres 1 (hPOT1) gene; polymorphism; single nucleotide; Helicobacter pylori

　　胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。目前研究表明胃癌是一种多基因病，其发生涉及到多种基因的异常改变，归因于环境与遗传因素的相互作用，其中幽门螺杆菌(H.pylori)感染是胃癌发生的主要危险因素，被WHO列为第一类致癌源。研究显示H.pylori是胃癌发生的启动和促进因子，感染率越高，胃癌发生率越高，死亡率越高[1]。研究中发现H.pylori感染能刺激胃黏膜细胞因子表达的增加，加重炎症反应，导致黏膜的损伤与胃酸分泌的异常，黏膜萎缩→肠上皮化生→异型增生→胃癌。在H.pylori感染导致胃癌发生的过程中，宿主的遗传因素也发挥十分重要的作用。单核苷酸多态性(SNP)指基因组中单个碱基的变异而导致的核酸序列多态性，是继微卫星之后的第3代遗传性标志,其决定了个体之间的差异暴露于相同的危险因素下，不同的人群有不同的结局。人端粒保护蛋白1基因(human protection of telomeres 1, hPOT1)是美国科学家Baumann等[2]于2001年发现的一种癌基因，是端粒家族成员之一，广泛存在于真核细胞中，被称为真核细胞看家基因。hPOT1的主要功能是维护端粒的功能，调控端粒长度，保护染色体稳定。hPOT1通过端粒酶依赖的途径负性调控端粒的长度，并导致端粒完整性破坏和不稳定性增加，引发DNA损伤反应，最终导致细胞凋亡。DNA损伤反应导致端粒功能失活，端粒功能失活限制了转化细胞的生长能力，使细胞永生化，也是肿瘤组织具有无限增殖能力的基础。H.pylori感染与hPOT1基因多态性的关系尚未见报道。为此在本研究中我们探讨胃癌中H.pylori感染与hPOT1基因单核苷酸多态性的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　收集2005年12月至2006年7月期间甘肃西部武威市三家医院外科手术切除的150例胃癌患者的胃癌组织，包括部分临床病理学资料。患者术前未行放疗和化疗，所有病例均经组织病理学确诊。取癌组织及手术切缘正常组织(距癌组织5 cm以上)，立即置于-70 ℃冰箱冻存备用。156例正常对照组为同期在三家医院查体并行胃镜检查者，在胃镜下排除慢性胃炎、肠化、增生、溃疡及癌变后，对照组年龄、性别与胃癌组匹配。两组均征得患者同意，所有受试者均签署知情同意书。胃癌组男性114例，女性36例，年龄31-76岁，平均55.93岁;对照组男性118例，女性38例，年龄28-73岁，平均54.63岁，全部检查对象均抽静脉血5 mL分离淋巴细胞，-70 ℃冰箱冻存备用。采用常规酚氯仿异戊醇抽取法提取DNA。

　　1.2 hPOT1基因单核苷酸多态性检测

　　1.2.1 SNP位点选择

　　从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP网站和NCI/CGAP /http:// snp500cancer.nci.nh.gov网站[3] 公布的hPOT135个SNP位点中，选择其中等位基因频率大于5%且有酶切位点的SNP位点hPOT1 IVS13-98G/T(ID：rs10250202);引物参照数据库中SNP位点周围的序列，由作者设计，上海生工合成。引物序列为：F-5′-GAGAATAGTCAGCCTCATTGTTTTT-3′，R-5′-TCTGATGCTGGAATCTGGAAG-3′，片段大小312 bp。

　　1.2.2 PCR扩增酶切测序

　　采用PCR-RFLP法。PCR扩增反应体系总体积25 μL，DNA模板300 ng、引物各1 μL(10 μmol/L)、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL(包括0.1 u Taq DNA聚合酶、每个500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl、pH8.3、20 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2、其他稳定剂和增强剂)，加双蒸水补充至25 μL。扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸7 min。PCR扩增完成后，取8 μL PCR扩增产物，20 g/L琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭染色)观察扩增情况，若出现312 bp清晰条带，则进行Mbo Ⅰ内切酶酶切分析。酶切反应体系10 μL，取8 μL PCR扩增产物、10×Buffer 1.0 μL、BSA 0.1 μL、限制性内切酶Mbo Ⅰ 1.0 μL(10单位)，于37 ℃温浴3 h，30 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。hPOT1 IVS13-98G/T分为3种基因型，GG、G和TT型(图1)。选择凝胶电泳证实为GG型、GT型、TT型各1例，由大连宝生物公司经双脱氧链终止法测序。

　　1.3 H.pylori的检测

　　1.3.1 PCR检测UreA基因

　　引物参照文献由上海生工合成[4]。上游引物：5′GCCAATGGTAAATTAGTT3′;下游引物：5′CTCCTTAATTGTTTTTAC3′，扩增片段长度为411 bp。反应体系为25 μL，包括2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，去离子水9.5 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min 1个循环;94 ℃ 1 min，47 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。产物于20 g/L的琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)电泳，紫外灯下观察结果。出现411 bp橙色条带的为H.pylori阳性，无条带则为阴性。

　　1.3.2 Warthin-Starry 银染色

　　阳性结果为细胞核和H.pylori均着棕黑色,细胞浆和黏液着浅黄色。PCR扩增和Warthin-Starry银染色均阳性者判断为H.pylori感染。

　　1.4 统计学分析

　　应用SPSS13.0统计软件处理。采用χ2检验比较hPOT1 IVS13-98G/T胃癌组和对照组的基因型分布和等位基因频率;用Hardy-weinberg平衡检验两位点基因型和等位基因频率分布是否具有群体代表性。OR和95%CI以非条件logistic回归模型计算。所有检验均为双侧概率检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 两组hPOT1 IVS13-98G/T各基因型及等位基因分布

　　胃癌组hPOT1 IVS13-98 GG、GT和TT基因型的频率分别为22.00%、41.67%和36.67%，G、T等位基因频率分别42.67%和57.33%;对照组GG、GT、TT基因型的频率分别为24.36%、51.92%、23.72%，G、T等位基因频率分别为49.68%和50.32%。两组G、T等位基因型频率比较无显著性差异(χ2=3.0257, P=0.0820)。以T/T基因型作为参照基因型，G/T和G/G两种基因型OR值分别为0.432(95% CI: 0.242-0.772, P=0.005)、0.540(95% CI: 0.274-1.064，P=0.075)。胃癌中3种基因型H.pylori的检出率无统计学意义(P>0.05)。

　　2.2 H.pylori感染与hPOT1基因单核苷酸多态性的关系

　　H.pylori(+)者81例，占54.00%，H.pylori(-)者69例，占46.00%;在hPOT1 IVS-98 G/T三种基因型中，GG基因型H.pylori检出率为51.52%，GT基因型为45.16%，TT基因型为65.45%，三型之间比较差异无统计学意义(χ2=4.937, P=0.085)。提示胃癌患者hPOT1 IVS-98 G/T多态性与H.pylori感染无关(表1)。表1 胃癌组H.pylori感染与hPOT1IVS-98 G/T多态性的关系(略)

　　3 讨 论

　　hPOT1基因位于7q31.33，编码蛋白质是单链端粒DNA结合蛋白。作为多蛋白复合体(TERT、POT1、TNKS、TERF1、TINF2和TERF2)成员之一，有其特有的分子结构，与端粒TTAGGG重复单链序列结合，有5种剪接变体，产生5种变异体蛋白。变体1hPOT1蛋白，与端粒单链DNA结合能力中等，促进端粒延长能力强;变体2是在外显子12和13之间插入12a所产生，与hPOT1蛋白相比，与端粒单链DNA结合能力强，促进端粒延长能力弱。hPOT1的功能是调节端粒长度，保护染色体末端，阻止染色体异常重组和分离，维持染色体稳定[5]。Kondo等[6]研究结果显示，在胃癌的早期出现hPOT1表达的下调，而晚期出现上调，可能反映了早期胃癌组织中出现端粒功能紊乱，通过上调来保护晚期胃癌的端粒，hPOT1表达水平的改变与胃癌的发生、发展有关。Yasui等[7]认为POT1是高度恶性或晚期肿瘤的标志。随着人类基因组计划的进展，Jiang等[8]对SNP数据库进行大范围评估，结果显示，SNP能够为研究多基因复杂疾病及个体间、不同群体或个体对肿瘤患病风险以及对药物反应的不同提供新方法。Savage等[9]用测序方法分析4个不同种族118个个体的端粒相关基因(TERT、TERC、TERF1、TERF2、TINF2、TERF2IP、POT1和TNKS)共同的SNPs，认为这些变异对研究遗传相关疾病如癌症、再生障碍性贫血、自身免疫性疾病及染色体异常和端粒酶异常都有重要意义。本研究结果显示，胃癌组与健康对照相比，POT1IVS13-98 G/T位点的等位基因频率分布无显著性差异，病例组含有较高比例T/T基因型，G/T有显著性统计学差异，提示G/T基因型可能降低胃癌的危险性，说明POT1IVS13-98 G/T位点单核苷酸多态性可能为胃癌的保护因素。

　　在H.pylori感染引发胃癌的同时，宿主的遗传因素也在发挥其重要的作用。陈威等[10]研究发现，H.pylori感染与细胞因子的单核苷酸多态性之间存在某种联系，在胃癌的发生、发展中起着一定的作用。本研究分析了胃癌黏膜H.pylori感染与hPOT1单核苷酸多态性的关系，结果显示，150例胃癌中H.pylori(+)81例，占54.00%，H.pylori(-)69例，占46.00%，3型H.pylori检出率比较差异无统计学意义，提示胃癌hPOT1 IVS-98 G/T单核苷酸多态性与H.pylori感染无关。但本组检测的均为胃癌组织，胃癌黏膜因内环境的改变，不利于H.pylori的生存，可能不能反映既往H.pylori感染的情况，因此H.pylori感染与hPOT1单核苷酸多态性之间的关系仍需进一步研究。

　　【参考文献】

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　　[5]Baumann P, Podell E, Cech TR, et al. Human POT1 (protection of telomeres) protein: cytolocalization, gene structure, and alternative splicing [J]. Mol Cell Biol, 2002, 22(22):8079-8087.

　　[6]Kondo T, Oue N, Yoshida K, et al. Expression of POT1 is associated with tumor stage and telomere length in gastric carcinoma [J]. Cancer Res, 2004, 64(2):523-529.

　　[7]Yasui W, Oue N, Aung PP, et al. Molecular-pathological prognostic factors of gastric cancer: a review [J]. Gastric Cancer, 2005, 8(2):86-94.

　　[8]Jiang R, Duan J, Windermuth A, et al. Genome-wide evaluation of the public SNP databases [J]. Pharmacogenomics, 2003, 4(6):779-789.

　　[9]Savage SA, Stewart BJ, Eckert A, et al. Genetic variation, nucleotide diversity, and linkage disequilibrium in seven telomere stability genes suggest that these genes may be under constraint [J]. Hum Mutat, 2005, 26(4):343-350.

　　[10]陈威，袁媛. 幽门螺杆菌感染与细胞因子单核苷酸多态性 [J]. 世界华人消化杂志, 2005, 13(17):2108-2114.